miR-122靶向調(diào)控心肌樣細胞誘導(dǎo)分化過程中GATA4基因的表達

郭勵京 張 志 劉紫東 付 偉 季 州

miR-122靶向調(diào)控心肌樣細胞誘導(dǎo)分化過程中GATA4基因的表達

郭勵京 張 志△劉紫東 付 偉 季 州

目的 實現(xiàn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bMSCs）向心肌樣細胞的誘導(dǎo)分化，并驗證分化過程中miR-122靶向調(diào)控GATA4基因的表達。方法首先，分離培養(yǎng)bMSCs，應(yīng)用5-氮雜胞苷（5-azacytidine）將其誘導(dǎo)分化為心肌樣細胞。然后，采用靶基因預(yù)測軟件miRanda和TargetScan對miR-122和GATA4基因的靶向匹配關(guān)系進行預(yù)測并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)鑒定。qRT-PCR檢測誘導(dǎo)分化過程中miR-122和GATA4的表達。結(jié)果誘導(dǎo)分化后的細胞平行排列，緊密相連，形態(tài)規(guī)則均一，免疫熒光化學(xué)顯示有心肌肌鈣蛋白I（cTnI）表達。生物信息學(xué)方法預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-122和GATA4基因兩者匹配良好，通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)miR-122能結(jié)合到GATA4 mRNA的3′UTR并有效抑制其表達。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，miR-122的表達水平與GATA4表達呈負相關(guān)。結(jié)論miR-122能調(diào)控心肌樣細胞誘導(dǎo)分化過程中GATA4的表達。

間質(zhì)干細胞；微RNAs；GATA4轉(zhuǎn)錄因子；3′非翻譯區(qū)；計算生物學(xué)；大鼠,Sprague-Dawley；miR-122；心肌樣細胞

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的小的非編碼RNA（small noncoding RNA），長度約為21～25 nt，可通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）完全或部分互補，進而降解該目的mRNA或阻止其翻譯成相關(guān)蛋白，下調(diào)靶基因表達[1]，以此參與個體發(fā)育、細胞分化、細胞增殖以及疾病發(fā)生過程中的基因表達調(diào)控。GATA4是心肌細胞發(fā)育過程中最早表達的轉(zhuǎn)錄因子之一，在胚胎心臟發(fā)育的整個過程中均表達，對心肌細胞的分化起重要作用，是調(diào)控心臟發(fā)育以及心肌細胞增殖、分化和調(diào)亡的重要轉(zhuǎn)錄因子[2-4]。本研究應(yīng)用5-氮雜胞苷（5-azacytidine）誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bMSCs）分化為心肌樣細胞，利用生物信息學(xué)對miR-122和GATA4基因的靶向匹配關(guān)系進行預(yù)測，并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)鑒定，實時定量PCR（qRT-PCR）檢測誘導(dǎo)分化過程中miR-122和GATA4的表達，以闡明miR-122對GATA4基因表達的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠，普通級，3～6周齡，體質(zhì)量80～120 g，購于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，生產(chǎn)許可證SCXK(遼) 2008-0005。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒和細胞系 E.coli DH5α感受態(tài)細胞和pMD 18-T載體購自TaKaRa公司，pmirGLO載體購自Promega公司，NIH3T3細胞系為遼寧醫(yī)學(xué)院附屬三院心內(nèi)科保存。

1.1.3 主要試劑與儀器 LG-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶購于Hyclone公司，CD34、CD44、CD29和CD166熒光標記抗體購于Biolengent公司，5-azacytidine購自Sigma公司，兔抗大鼠多克隆心肌肌鈣蛋白I（cTnI）抗體購自Santa Cruz公司，RNAiso Plus、RNAiso for small RNA、Prime-Script?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ、限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0購于TaKaRa公司，AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒和AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒購自Axygen公司，Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，miRNA模擬物由GenePharma公司合成，Dual-Luciferase?報告基因檢測系統(tǒng)和發(fā)光檢測儀購自Promega公司，實時定量PCR儀購于Bio-Rad公司。

1.2 bMSCs的分離與培養(yǎng) 取4～6周SD大鼠，脫頸處死，70%乙醇浸泡5 min，取其股骨和脛骨，PBS洗凈，去掉干骺端，用1 mL無菌注射器，吸取1 mL含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素的DMEM，反復(fù)沖出骨髓，吹打均勻后，接種到25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后，換液棄去未貼壁細胞。每3～4 d換一次液，待細胞達到80%融合后傳代，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化3 min，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，收集細胞1∶2傳代，記作P1。

1.3 流式細胞儀鑒定bMSCs 收集P3代細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，分裝于6只1.5 mL離心管內(nèi)，每管1 mL，分別與FITC和PE熒光素標記的CD29、CD34、CD44、CD166抗體孵育1 h后，上流式細胞儀檢測。

1.4 心肌樣細胞的誘導(dǎo)分化及鑒定 （1）誘導(dǎo)分化。取P3細胞接種于培養(yǎng)瓶和鋪有血蓋片的6孔板內(nèi)做誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)基中加入10 μmol/L 5-azacytidine培養(yǎng)24 h后，PBS沖洗2次，更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細胞的形態(tài)。（2）免疫熒光檢測cTnI的表達。取細胞爬片PBS沖洗后，在冷空氣中迅速干燥，用4%甲醛固定20 min，PBS沖洗3次，每次5 min，0.1%BSA封閉1 h，加兔抗大鼠多克隆cTnI抗體，室溫孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min，二抗加FITC標記山羊抗兔IgG抗體，抗體濃度（1∶200），Hochest 33258復(fù)染細胞核。

1.5 生物信息學(xué)預(yù)測 采用靶基因預(yù)測軟件miRanda(http:// www.microrna.org/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/)對 miR-122和GATA4基因的靶向匹配關(guān)系進行預(yù)測。

1.6 miR-122靶基因GATA4的鑒定

1.6.1 GATA4 3′UTR的克隆 取誘導(dǎo)培養(yǎng)20 d的心肌樣細胞，加入RNAiso Plus提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，紫外分光光度計檢測總RNA純度和濃度，用RNasefree水稀釋為1 g/L，按PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用正向引物5′-CCGAGCTCCCTGCCCTTGTCCAACACTC-3′和反向引物5′-GCTCTAGACCTTCTCCTCACCTAAACCC-3′擴 增 GATA4 mRNA的3′UTR片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并按AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明回收目的片段，克隆到pMD 18-T載體上，測序。

1.6.2 GATA4 3′UTR-pmirGLO熒光素酶報告載體的構(gòu)建 分別用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切pmirGLO質(zhì)粒載體以及回收得到的GATA4 3′UTR，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物及膠回收，按DNA Ligation Kit Ver 2.0說明，將回收的GATA4 3′UTR酶切片段與pmirGLO載體酶切片段相連，構(gòu)建GATA4 3′UTR-pmirGLO熒光素酶報告載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞中克隆擴增，按照AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒說明從菌液中提取重組質(zhì)粒，用SacⅠ和XbaⅠ酶切質(zhì)粒鑒定。

1.6.3 NIH3T3細胞轉(zhuǎn)染與熒光素酶檢測 NIH3T3細胞培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化細胞并計數(shù)，細胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%～95%。對于每孔細胞，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染GATA4 3′UTR-pmir-GLO 200 ng以及miR-122模擬物或?qū)φ誱iRNA 30 nmol/L，轉(zhuǎn)染24 h后，按照Dual-Luciferase?報告基因檢測系統(tǒng)說明檢測不同處理組的熒光強度。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個轉(zhuǎn)染實驗重復(fù)3次。

1.7 qRT-PCR檢測miR-122及GATA4的表達 取誘導(dǎo)5、9、13、17和21 d的細胞，分別加入RNAiso for small RNA或RNAiso Plus提取總miRNA或總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，紫外分光光度計檢測純度和濃度，用RNase-free水稀釋為1 g/L，按照One Step PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis Kit說明書反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA樣品稀釋4倍，加入SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ和miR-122檢測引物（通用檢測引物試劑盒自帶）或GATA4檢測引物，見表1，以U6或GAPDH為內(nèi)參基因，在Chromo4TM多色實時定量PCR儀(Biorad)上進行40個循環(huán)的qPCR反應(yīng)，應(yīng)用Opticon-3軟件定量分析反應(yīng)結(jié)果，miR-122和GATA4 mRNA的表達量分別用U6和GAPDH標準化。每次定量分析檢測樣品設(shè)置3個重復(fù)，以3批樣品進行獨立表達分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，兩變量關(guān)聯(lián)性應(yīng)用Pearson相關(guān)進行分析，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 bMSCs流式細胞儀鑒定結(jié)果 大鼠bMSCs高表達間充質(zhì)干細胞相關(guān)標志物CD29（90.12%）、CD44（94.62%）、CD166（63.27%），而造血干細胞標志物CD34（1.23%）表達陰性，見圖1。

2.2 誘導(dǎo)后細胞形態(tài)學(xué)觀察 bMSCs傳至3～4代，分布均勻，呈梭形，折光性強，見圖2A。誘導(dǎo)3周后細胞變細長，平行排列，緊密相連，形態(tài)規(guī)則均一，見圖2B；細胞免疫熒光顯示分化2周后細胞內(nèi)有cTnI表達，顯示綠色熒光，見圖2C～E。

2.3 miR-122和GATA4靶向匹配關(guān)系預(yù)測結(jié)果 TargetScan結(jié)果表明miR-122在GATA4 mRNA的3′UTR上有1個哺乳動物間保守的靶位點，靶位點類型為7mer-m8，“context+score”百分數(shù)為56，其與靶位點互補情況良好。miRanda顯示miR-122與靶位點匹配的mirSVR得分為-0.143 7，miRNA與3′UTR結(jié)合情況良好，見表2。

2.4 miR-122可直接調(diào)控GATA4的表達 熒光強度分析結(jié)果顯示，將對照組miRNA（在小鼠細胞系中無任何靶基因）的熒光素酶活性設(shè)定為1時，miR-122組的熒光素酶活性為（53.74±6.38）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.648，P=0.007）。

2.5 心肌樣細胞誘導(dǎo)分化的過程中miR-122和GATA4的表達關(guān)系 qRT-PCR結(jié)果顯示，將誘導(dǎo)5 d細胞mRNA的表達量值設(shè)為1時，誘導(dǎo)9 d GATA4 mRNA的表達量為4.54±1.82，誘導(dǎo)21 d時升至11.71±6.84，而miR-122的表達量誘導(dǎo)9 d下降為（57.76±7.57）%，誘導(dǎo)21 d下降至（23.86±5.64）%，見圖3。隨著誘導(dǎo)時間的延長，miR-122與GATA4表達水平呈負相關(guān)（n=8，r=-0.863，P=0.006）。

3 討論

GATA家族是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，目前已知有6個成員，因其識別序列(A/T)GATA(A/G)而得名，根據(jù)組織分布以及氨基酸序列同源程度分為2個亞家族：GATA1～3主要在造血系統(tǒng)中表達，而GATA4～6主要在內(nèi)胚層和中胚層來源的組織中表達，如心臟、肝臟、消化系統(tǒng)和生殖腺等[5]。GATA4是近年來心血管領(lǐng)域的研究熱點，GATA4基因敲除小鼠由于心臟發(fā)育缺陷致胚胎期死亡[5]；過表達的GATA4可促進P19細胞向心肌細胞分化[6]。Ieda等[7]研究發(fā)現(xiàn)GATA4、Tbx5與MEF2c轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合作用可將心臟成纖維細胞及皮膚成纖維細胞誘導(dǎo)成為心肌樣細胞，而且，GATA4還能調(diào)控心臟成纖維細胞的增殖[8]。GATA4能調(diào)控Bcl基因發(fā)揮抗凋亡作用[9]。這些研究均證明GATA4是調(diào)控心臟發(fā)育以及心肌細胞增殖、分化和凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子。GATA4還是許多信號通路中MAPK激酶ERK和p38的下游靶標[10]。因此，GATA4是多種信號通路的整合者及下游效應(yīng)分子，在心臟發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。

miRNA作為一類小的內(nèi)源性非編碼RNA已被證實廣泛參與生命活動過程中的基因表達調(diào)控，但對于miRNA參與心肌樣細胞誘導(dǎo)分化方面卻知之甚少，為此，本研究運用靶基因預(yù)測軟件miRanda和TargetScan對miR-122和GATA4基因的靶向匹配關(guān)系進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)兩者匹配關(guān)系良好。miRanda是第一個靶基因預(yù)測軟件，其適用范圍寬廣，不受物種限制，除了傳統(tǒng)的miRNA與靶基因堿基互補方面的要求外，Betel等[11]更新了算法mirSVR，作為一種新的機器學(xué)習(xí)方法，mirSVR將預(yù)測的靶位點的序列和結(jié)構(gòu)特征（contextual features）整合并建立回歸模型，不需要定義種子區(qū)亞類（seed subclasses）。然而，TargetScan是用于預(yù)測哺乳動物miRNA靶基因的軟件，其以靶基因跨物種保守和miRNA-靶基因二聚體熱力學(xué)特征為基礎(chǔ)，并首次引入假陽性率來評價靶基因預(yù)測結(jié)果。后來，Lewis等[12]將TargetScan優(yōu)化為TargetScanS,把miRNA種子區(qū)修訂為5＇端第2到7位堿基，并根據(jù)靶位點與miRNA的互補情況，將靶位點分為3種類型：與miRNA種子區(qū)精確匹配且與miRNA第1位核苷酸對應(yīng)處為A(7mer-1A sites)，與miRNA第2到8位精確匹配（7mer-m8 sites），與miRNA第2到8位精確匹配且與miRNA第1位核苷酸對應(yīng)處為A（8mer sites）。

筆者進一步通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-122能夠靶向作用于GATA4 3＇UTR抑制GATA4的表達。qRT-PCR結(jié)果表明，隨著誘導(dǎo)時間的延長，miR-122的表達量逐漸降低，而GATA4的表達量逐漸升高，兩者呈負相關(guān)，與熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結(jié)果相符，提示miR-122參與了心肌樣細胞的誘導(dǎo)分化過程，其具體的調(diào)節(jié)機制及與其他幾種重要轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系還需進一步的研究。

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（2013-10-10收稿 2013-12-02修回）

（本文編輯 李國琪）

GATA4 Expression During Induction of the Cardiomyocyte-Like Cells Differentiation Regulated by miR-122

GUO Lijing,ZHANG Zhi,LIU Zidong,FU Wei,JI Zhou
Department of Cardiology,The Third Affiliated Hospital,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China

ObjectiveTo identify the miR-122 which regulateing GATA4 expression during the induction of rat bone marrow mesenchymal stem cells(bMSCs)differentiating into cardiomyocyte-like cells.MethodsBMSCs were isolated from bone marrow and induced to differentiate into cardiomyocyte-like cells using 5-azacytidine.The miR-122 which may regulate expression of GATA4 were predicted using miRanda and TargetScan softwares and identified by dual luciferase report system.The expressions of miR-122 and GATA4 were determined using q-PCR during the differentiation of bMSCs into cardiomyocyte-like cells.ResultsThe induced cells were completely in contacted with adjoining cells and uniform in shape and aligned parallelly.Cardiac troponin I(cTnI)expression was detected by immunofluorescence cytochemistry.Using dual luciferase reporter system in vitro,miR-122 were proved to be able to effectively inhibit GATA4 expression by binding the 3′UTR of GATA4 mRNA.q-PCR results showed that the expression of miR-122 is negatively correlated with that of GATA4 mRNA transcription.ConclusionThese results indicated that miR-122 regulate the expression of GATA4 during the induction of cardiomyocyte-like cells.

mesenchymal stem cells;MicroRNAs;GATA4 transcription factor;3′untranslated regions;computational biology;rats,Sprague-Dawley;miR-122;cardiomyocyte-like cells

Q522,R318.04

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.013

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科（郵編121001）

△通訊作者 E-mail:ningcheng631@163.com