苦瓜總皂苷對2型糖尿病大鼠降血糖作用機制的研究*

馬春宇 于洪宇 王慧嬌 耿麗晶 關(guān)洪全

苦瓜總皂苷對2型糖尿病大鼠降血糖作用機制的研究*

馬春宇1,2于洪宇2王慧嬌2耿麗晶2關(guān)洪全1△

目的 探討苦瓜總皂苷對2型糖尿病大鼠的降血糖機制。方法取清潔級雄性SD大鼠60只，隨機取8只作為正常對照組，其余的用高脂高糖飲食喂養(yǎng)8周后用小劑量鏈脲佐菌素(STZ)尾靜脈注射建2型糖尿病大鼠模型。將合格的糖尿病模型大鼠40只分為模型組、二雙胍組和3個劑量（100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg）苦瓜總皂苷組，每組8只。二甲雙胍組每天給予二甲雙胍50 mg/kg，苦瓜總皂苷100組、200組和400組：分別每天給予100、200和400 mg/kg苦瓜總皂苷，灌胃8周后分別測定大鼠空腹血糖、胰島素，同時留取胰島、肝臟和骨骼肌，分別用電鏡、糖原染色和Western blot的方法觀察胰島β細胞結(jié)構(gòu)、肝糖原和骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）表達量。結(jié)果給藥8周后，與模型組比較，各苦瓜總皂苷組大鼠的空腹血糖和胰島素值均顯著降低，而骨骼肌GLUT4表達量顯著增高，胰島素分泌顆粒顯著增加，肝臟糖原顆粒數(shù)量也明顯增加。結(jié)論苦瓜總皂苷有降血糖作用，其機制主要包括促進肝糖原合成、抑制肝糖原分解以及通過外周組織GLUT4表達增強進而增加胰島素敏感性等。

苦瓜；糖尿病，2型；血糖；胰島素；葡萄糖轉(zhuǎn)運體4型；苦瓜總皂苷

2型糖尿是發(fā)病率和死亡率最高的三大慢性疾病之一，且發(fā)病率仍逐年上升，在中國尤為明顯[1]。糖尿病后期引發(fā)的多種并發(fā)癥是患者致殘和致死的主要原因，而高血糖及血糖波動是發(fā)生并發(fā)癥的重要因素，故平穩(wěn)降血糖是糖尿病治療的首要任務(wù)。中藥具有不良反應(yīng)小、作用持久及臨床療效良好等優(yōu)點，在糖尿病及其并發(fā)癥的治療上具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其單味中藥治療糖尿病日益引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

近年來，苦瓜已成為國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究熱點，其中研究最多的是苦瓜粗提物的作用。苦瓜粗提物的主要成分為苦瓜皂苷，許多研究都證明了苦瓜總皂苷對2型糖尿病動物有降血糖作用[2-3]。本研究通過建立2型糖尿病大鼠模型，采用苦瓜總皂苷對其治療，觀察苦瓜總皂苷對2型糖尿病大鼠的血清指標(biāo)、胰島細胞形態(tài)、肝糖原和骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）表達的影響，從而探討其降糖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料 清潔級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～240 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK2010-0001。高脂高糖飼料成分比例為標(biāo)準(zhǔn)飼料∶白糖∶豬油∶蛋黃＝60∶17∶20∶3，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及藥品 STZ，美國Sigma公司；二甲雙胍，山東東方福瑞達制藥有限公司；糖原染色液試劑盒，南京建成科技有限公司；苦瓜總皂苷由遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院提供，為棕褐色粉末，經(jīng)高效液相色譜法測定苦瓜總皂苷含量為57.2%。胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、Western blot用抗體均由RD公司國內(nèi)分裝。

1.3 主要實驗儀器 7600-20型全自動生化分析儀，日本日立公司；安準(zhǔn)血糖測試儀，三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司；DNM-9602G型酶標(biāo)儀，上海；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡，日本；JC303-4型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海；MP200A電子天平，上海；Axioimager A1型熒光顯微鏡，德國Zeiss公司；VCX105型超聲波細胞破碎儀，美國；UVP凝膠成像分析系統(tǒng)，美國；3k15型低溫高速離心機，德國Sigma公司。

1.4 2型糖尿病大鼠模型的建立 大鼠分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性普通飼料喂養(yǎng)1周，溫度(20±2)℃，濕度(60±5)%。除對照組大鼠外均高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后禁食12 h，STZ溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH4.5)后，尾靜脈注射STZ溶液25 mg/kg。72 h后測定血糖值，以空腹血糖≥11.1 mmol/L為糖尿病大鼠造模成功。

1.5 動物分組及給藥 選合格的糖尿病模型大鼠40只，均分為5組，每組8只。模型組：不做任何處理；二甲雙胍組：每天給予50 mg/kg二甲雙胍；苦瓜總皂苷100組、200組和400組：分別每天給予100、200和400 mg/kg苦瓜總皂苷，均采用灌胃給藥方式連續(xù)給藥8周。另選取正常大鼠8只為對照組。

1.6 標(biāo)本采集、處理及指標(biāo)測定 給藥8周末稱質(zhì)量，腹腔注射戊巴比妥鈉(120 mg/kg)麻醉已禁食大鼠，取鼠尾血用血糖儀測定血糖值。仰臥式固定大鼠后開胸，用注射器從心尖取血4 mL裝于促凝管中，離心后將血清裝于EP管于-20℃保存，用ELISA法按照試劑盒說明書檢測大鼠血清胰島素，剩余血清送檢測血糖。每組大鼠采血后，快速取肝臟、胰腺、大腿骨骼肌，分別剪取部分組織用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定，標(biāo)記后-80℃冰箱保存。用透射電鏡觀察胰腺胰島β細胞，用過碘酸-希夫氏(PAS)染色觀察肝臟組織中糖原的量，Western blot檢測骨骼肌中GLUT4的表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間多重比較用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦瓜總皂苷對2型糖尿病大鼠空腹血糖、血清胰島素和骨骼肌GLUT4表達的影響 與對照組相比，模型組的空腹血糖、胰島素均明顯增加，而GLUT4表達量明顯減少（P＜0.01）。給藥8周后，與模型組比較，3個苦瓜總皂苷組和二甲雙胍組大鼠的空腹血糖和胰島素值均降低，而骨骼肌GLUT4表達量均升高(P＜0.01)。見表1、圖1。

Table1 Comparison of the fasting blood glucose, insulin and the GLUT4 expression level in the different rat groups表1 各組大鼠空腹血糖、胰島素及骨骼肌GLUT4表達水平比較 （n=8±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.01

組別對照組模型組二甲雙胍組苦瓜總皂苷100組苦瓜總皂苷200組苦瓜總皂苷400組F空腹血糖(mmol/L) 4.88±1.02 16.63±3.18a7.28±1.75b10.16±1.84b8.14±1.56b7.41±1.78b42.728＊＊空腹血清胰島素(mIU/L) 10.64±1.87 15.89±1.94a11.93±1.73b14.35±1.86b12.97±1.95b12.06±1.74b5.124＊＊GLUT4表達的相對灰度值1.08±0.11 0.38±0.04a1.23±0.09b1.01±0.09b1.36±0.12b1.81±0.25b126.017＊＊

2.2 苦瓜總皂苷對2型糖尿病大鼠胰島β細胞超微結(jié)構(gòu)的影響 正常對照大鼠β細胞核呈卵圓形或圓形，胞質(zhì)內(nèi)有大量大小不一的分泌顆粒，顆粒內(nèi)有大小不同的致密核芯，核芯與界膜之間有較寬的清亮間隙，見圖2A。模型大鼠胰島β細胞核固縮，核膜凹陷，分泌顆數(shù)量減少，空暈增寬，核芯縮小，有的界膜破裂，相互融合，見圖2B。苦瓜總皂苷組和二甲雙胍組相似，β細胞分泌顆粒數(shù)量較模型組增加，但仍少于對照組，分泌顆粒的核芯與界膜之間空暈較清晰。隨苦瓜總皂苷劑量的增加分泌顆粒有增多的趨勢，見圖2C～F。

2.3 苦瓜總皂苷對肝臟糖原含量的影響 糖原在PAS染色后顯色呈紫紅色顆粒，對照組大鼠的肝臟細胞中紫紅色糖原顆粒分布均勻；模型組大鼠肝臟中紫紅色糖原顆粒含量明顯較對照組大鼠少，分布不均，局部甚至消失。苦瓜總皂苷低劑量組和二甲雙胍組肝臟糖原顆粒數(shù)量與模型組無明顯差異，而苦瓜總皂苷200組、400組的肝臟糖原顆粒數(shù)量較模型組大鼠有所增加，而且分布均勻，苦瓜總皂苷400組的糖原顆粒分布接近對照組水平，見圖3。

3 討論

本研究用高脂高糖飲食結(jié)合小劑量STZ尾靜脈注射的方法成功獲得2型糖尿病大鼠模型，大鼠表現(xiàn)為高血糖、高胰島素血癥。通過8周的治療可以證實苦瓜總皂苷能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖和血清胰島素水平。隨苦瓜總皂苷的劑量增加，血糖和胰島素降低更加明顯，400組的降糖作用與二甲雙胍相當(dāng)，說明苦瓜總皂苷的降糖作用是溫和而持久的。

血糖水平的維持主要與胰島β細胞功能、肝臟的糖原合成分解功能、外周組織對葡萄糖的利用等密切相關(guān)。GLUT4主要分布于胰島素敏感細胞如肌肉細胞中，是將葡萄糖從血液轉(zhuǎn)移到組織細胞中進行利用的主要蛋白。GLUT4表達量的多少可以反映出葡萄糖的利用程度。GLUT4表達量下降導(dǎo)致骨骼肌、心肌和脂肪組織對葡萄糖攝取利用減少是胰島素抵抗的重要分子基礎(chǔ)，是誘發(fā)2型糖尿病的原因之一[4]。本研究發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，模型組的GLUT4表達量明顯降低，而二甲雙胍組和苦瓜總皂苷組明顯增加，增加幅度隨苦瓜總皂苷的劑量而增加。結(jié)合血清胰島素水平的降低，可以推測苦瓜總皂苷的降血糖作用之一是通過增加GLUT4的轉(zhuǎn)運和數(shù)量而加速葡萄糖的利用，進而增加胰島素的敏感性。GLUT4的表達增強是外周組織加強對葡萄糖利用的中心環(huán)節(jié)，很可能與磷酸腺苷活化的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）通路的增強有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)苦瓜皂苷可以使細胞中的AMPK活性增強[5]，而AMPK通路的激活恰恰是胰島素發(fā)揮作用的始動因素，進而增加GLUT4的表達和葡萄糖的攝取[6]?？喙显碥粘耸笹LUT4表達增強之外，還能增加胰島素轉(zhuǎn)運受體底物的磷酸化速率[7]，也說明了苦瓜總皂苷的降血糖的重要機制之一就是提高外周組織對胰島素的敏感性。

本研究通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的胰島β細胞有明顯的損傷，分泌顆粒數(shù)量減少，而苦瓜總皂苷的各治療組大鼠胰島β細胞形態(tài)有所修復(fù)，分泌顆粒數(shù)量有所增多。雖然胰島β細胞分泌顆粒有所增加[8]，胰島β細胞有所修復(fù)，但血清胰島素水平卻有所降低，說明苦瓜總皂苷有使外周組織對胰島素的利用增強或有類胰島素的作用，進而減輕了胰島β細胞分泌胰島素的負(fù)擔(dān)，間接地起到了保護和修復(fù)胰島β細胞的作用?？喙峡傇碥湛赡苤荒苄迯?fù)未完全受損的胰島β細胞，而對完全壞死的胰島β細胞是沒有再生和修復(fù)作用的。

通過肝糖原PAS染色發(fā)現(xiàn)，與對照組大鼠相比，模型組的糖原含量明顯減低，而通過藥物治療后，肝糖原的含量均有所增加，其中苦瓜總皂苷治療各組隨其劑量的增加而增加，苦瓜總皂苷400 mg/kg劑量組的肝糖原含量與正常對照組相當(dāng)，說明苦瓜總皂苷有增加肝糖原的作用。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素可以使糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3)磷酸化，進而抑制糖原合成酶的活性，而苦瓜總皂苷有類似胰島素樣結(jié)構(gòu)可以阻止GSK-3的磷酸化，進而促進糖原的合成和抑制糖原的分解[9]。

綜上，苦瓜總皂苷的降血糖機制可能是促進肝糖原的合成、抑制肝糖原的分解以及提高外周組織的胰島素敏感性等。

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（2013-10-25收稿 2014-01-01修回）

（本文編輯 閆娟）

Hypoglycemic Mechanism of Total Saponins of Momordica Charantia in Type 2 Diabetes Mellitus Rats

MA Chunyu1,2,YU Hongyu2,WANG Huijiao2,GENG Lijing2,GUAN Hongquan1
1 Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning 110032，China;2 Liaoning Medical University

Objective To observe the hypoglycemic mechanism of total saponins of Momordica charantia(MC)in type 2 diabetes mellitus(DM)rats.MethodsAmong the selected 60 male Specific Pathogen Free(SPF)rats,8 were randomly chosen as control group,while others were fed with high fat and high glucose diet following streptozotocin injection from caudal vein 8 weeks after to construct type 2 DM models.After the DM models were successfully built,rats were then randomized into five groups:DM control group(n=8),the metformin group(n=8)and three groups of total saponins of MC with different dosage(n=8 in each group).The total saponins of MC groups include DM rats administrated with total saponins of MC 100,200,400 mg/(kg·d)for 8 weeks,the metformin group include DM rats administrated with metformin 50 mg/(kg·d) for 8 weeks.At the end of the experiment,the fasting blood glucose and insulin were examed.At the same time,a part of pancreas islet,liver and skeletal muscle were preserved.The pancreas islet structure,the hepatic glycogen and Glucose transporter 4(GLUT4)expression were observed by electron microscope,glycogen dyeing and immunoblot respectively.ResultsAfter 8 weeks treatment,compared to type 2 DM control group,fasting blood glucose and insulin values in MC groups were reduced more obviously.However,skeletal muscle GLUT4 expression level,insulin granules and hepatic glycogen increased obviously in MC groups.ConclusionTotal saponins of MC has hypoglycemic effect.It’s mechanisms maybe include promoting the hepatic glycogen synthesis,inhibiting the hepatic glycogen decomposition and promoting insulin sensitivity by increasing peripheral tissue’s GLUT4 expression.

momordica charantia；diabetes mellitus,type 2；blood glucose；insulin；glucose transporter type 4；total saponins of momordica charantia

R587.1，R285.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.010

*遼寧省教育廳資助項目（項目編號：L2012305）

1遼寧沈陽，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)（郵編110032）；2遼寧錦州,遼寧醫(yī)學(xué)院

△通訊作者 E-mail：hongquanguan@sina.com