周細(xì)胞在子宮內(nèi)膜異位癥血管生成中的作用

趙采云 尹利榮 孫俊杰

周細(xì)胞在子宮內(nèi)膜異位癥血管生成中的作用

趙采云 尹利榮△孫俊杰

目的 探討周細(xì)胞在子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）血管生成中的作用。方法采用免疫組化方法（SP法）檢測(cè)60例EMs患者（EMs組）在位內(nèi)膜（增殖期、分泌期內(nèi)膜各20例）、異位內(nèi)膜20例及40例非子宮內(nèi)膜異位癥患者（對(duì)照組）子宮內(nèi)膜（增殖期、分泌期各20例），分別選用平滑肌肌動(dòng)蛋白α（α-SMA）標(biāo)記平均周細(xì)胞數(shù)（PN）和CD34標(biāo)記微血管密度（MVD），并對(duì)二者比值（PN/MVD）進(jìn)行比較，分析周細(xì)胞與EMs血管生成之間的關(guān)系。結(jié)果EMs組異位內(nèi)膜MVD高于正常增殖期和正常分泌期內(nèi)膜（P＜0.05），在位內(nèi)膜增殖期、分泌期的MVD與相應(yīng)的正常內(nèi)膜比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜組內(nèi)比較均為分泌期高于增殖期（P＜0.05）。EMs組異位內(nèi)膜PN低于正常增殖期內(nèi)膜（P＜0.05），與正常分泌期內(nèi)膜相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在位內(nèi)膜增殖期、分泌期的PN與相應(yīng)的正常內(nèi)膜相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組內(nèi)比較均分泌期低于增殖期（P＜0.05）；EMs組異位內(nèi)膜的PN/MVD低于正常增殖期和正常分泌期內(nèi)膜（P＜0.05）。在位內(nèi)膜無(wú)論增殖期還是分泌期的PN/MVD與相應(yīng)的正常內(nèi)膜比較，均為在位內(nèi)膜低于正常內(nèi)膜（P＜0.05），組內(nèi)比較均分泌期低于增殖期（P＜0.05）。結(jié)論周細(xì)胞對(duì)EMs血管生成起著重要作用，周細(xì)胞覆蓋率是判定子宮內(nèi)膜血管成熟度和穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。

子宮內(nèi)膜異位癥；新生血管化,生理性；周細(xì)胞；免疫組織化學(xué)；微血管密度；血管生成

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）是育齡期婦女的常見(jiàn)病、多發(fā)病，雖是良性疾病，卻具有種植、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，有“良性癌”之稱(chēng)。EMs的發(fā)生、發(fā)展及消退等過(guò)程高度依賴(lài)血管生成。大量關(guān)于血管生成的研究證實(shí)，周細(xì)胞在生理和病理性血管生成中起著重要的作用，周細(xì)胞不僅作為新生血管的重要組成部分參與血管生成，還具有調(diào)節(jié)血管成熟、穩(wěn)定的功能[1-3]。本研究采用免疫組織化學(xué)法（SP法）對(duì)異位、在位及正常子宮內(nèi)膜中微血管密度（MVD）和平均周細(xì)胞數(shù)（PN）進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩者的比值（PN/MVD）進(jìn)行分析，以探討周細(xì)胞在EMs血管生成中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年7月—2013年7月在我院婦科接受卵巢EMs病灶切除術(shù)或附件切除術(shù)，且術(shù)后病理檢查證實(shí)為卵巢EMs的患者60例作為研究組，年齡24～48歲，平均（34.0±7.4）歲，異位內(nèi)膜20例，在位內(nèi)膜40例（其中增殖期、分泌期內(nèi)膜各20例）。選取同期因子宮平滑肌瘤行手術(shù)治療的患者40例作為正常對(duì)照組，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜，排除子宮內(nèi)膜異位癥及子宮內(nèi)膜疾病，年齡28～50歲，平均（37.3±7.8）歲，其中正常增殖期、正常分泌期內(nèi)膜各20例。所有患者月經(jīng)周期規(guī)律，無(wú)婦科內(nèi)分泌疾病、生殖系統(tǒng)腫瘤及感染，手術(shù)前6個(gè)月未接受激素治療、無(wú)妊娠及哺乳史。標(biāo)本采集均經(jīng)患者知情同意。

1.2 主要試劑及方法 鼠抗人原始造血細(xì)胞CD34單克隆抗體、即用型鼠抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體以及即用型SP試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水至石蠟包埋,行4～5 μm厚切片，烤片后行HE染色，經(jīng)病理醫(yī)師確診為研究所需內(nèi)膜，后行免疫組化染色?？乖迯?fù)使用高溫修復(fù)法，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，DAB顯色，經(jīng)蘇木素復(fù)染、封片、觀察，檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中CD34、平滑肌肌動(dòng)蛋白α（α-SMA）的表達(dá)。已知胰腺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)的定性與定量 切片分別于低倍鏡和高倍鏡下觀察，抗體抗原陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色，且染色明顯高于背景，CD34為內(nèi)皮細(xì)胞胞膜陽(yáng)性，SMA為周細(xì)胞胞漿陽(yáng)性。MVD計(jì)數(shù)：首先在×100視野下選擇計(jì)數(shù)部位，然后在×400視野下計(jì)數(shù)CD34陽(yáng)性的微血管數(shù)，單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞作為1個(gè)計(jì)數(shù)單位，不論是否形成管腔或管腔內(nèi)有無(wú)紅細(xì)胞，殘存血管或血管腔直徑＞8個(gè)紅細(xì)胞者不計(jì)數(shù)，每例分別讀取5個(gè)不重復(fù)的視野計(jì)數(shù)，然后計(jì)算單位視野（×400）的平均值，即為MVD。PN計(jì)數(shù)：首先在×100視野下選擇計(jì)數(shù)部位，在×400視野下計(jì)數(shù)微血管SMA陽(yáng)性的周細(xì)胞數(shù)，每例分別選取5個(gè)不重復(fù)的視野計(jì)數(shù)，計(jì)算單位視野的平均值，即為PN。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用±s表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜中MVD的比較 正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜相比較，CD34陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)呈逐漸增加趨勢(shì)，且同正常內(nèi)膜相比，異位內(nèi)膜內(nèi)由單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞組成、未形成管腔或直徑較小的微血管明顯增加，見(jiàn)圖1。各組內(nèi)膜MVD定量結(jié)果顯示：異位內(nèi)膜高于正常增殖期和正常分泌期內(nèi)膜（P＜0.05）；在位內(nèi)膜無(wú)論增殖期還是分泌期與相應(yīng)的正常內(nèi)膜相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在位內(nèi)膜分泌期高于增殖期，正常內(nèi)膜分泌期高于增殖期（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Table 1 Comparison of MVD、PN and PN/MVD level in endometrium between different groups表1 各組內(nèi)膜MVD、PN及PN/MVD水平比較（n=20，±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）比較，b與（2）比較，c與（3）比較，d與（4）比較，P＜0.05

組別異位內(nèi)膜（1）在位增殖期（2）在位分泌期（3）正常增殖期（4）正常分泌期（5）F MVD（條/HP）47.25±2.69 23.00±1.72 33.50±2.91b22.05±1.28a33.35±2.70ad377.36＊＊PN（個(gè)/HP）14.50±1.47 24.95±2.28 14.55±1.32b26.75±3.26a15.45±1.10d176.61＊＊PN/MVD 0.31±0.03 1.08±0.05 0.44±0.03b1.21±0.14ab0.46±0.03acd710.29＊＊

2.2 異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜PN的比較 正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜相比較，α-SMA陽(yáng)性的周細(xì)胞依次遞減，在正常內(nèi)膜中α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞位于微血管的外周，符合周細(xì)胞的組織學(xué)分布，并可見(jiàn)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞形成的條索狀或管腔樣微血管，而在異位內(nèi)膜中α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少，呈散在、單一細(xì)胞分布，不形成微血管樣結(jié)構(gòu)，多數(shù)微血管上無(wú)或僅有1個(gè)α-SMA細(xì)胞分布，見(jiàn)圖2。內(nèi)膜PN定量結(jié)果顯示：異位內(nèi)膜低于正常增殖期內(nèi)膜（P＜0.05），而與正常分泌期內(nèi)膜相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在位內(nèi)膜無(wú)論增殖期還是分泌期與相應(yīng)的正常內(nèi)膜相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在位內(nèi)膜增殖期高于分泌期，正常內(nèi)膜增殖期高于分泌期（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜PN/MVD的比較 異位內(nèi)膜低于正常增殖期和正常分泌期內(nèi)膜；在位內(nèi)膜無(wú)論增殖期還是分泌期均低于相應(yīng)的正常內(nèi)膜；在位內(nèi)膜增殖期高于分泌期，正常內(nèi)膜增殖期高于分泌期(均P＜0.05)，見(jiàn)表1。

3 討論

血管生成是指從已存在的血管生出新血管的過(guò)程，病理性血管生成主要發(fā)生于惡性腫瘤、缺血性、炎癥性疾病中[4]。周細(xì)胞是除內(nèi)皮細(xì)胞外血管的另一重要組分，周細(xì)胞在血管生成之前，其結(jié)構(gòu)和功能即發(fā)生改變，參與誘導(dǎo)血管生成；在血管生成初期起著引導(dǎo)和支持作用[5]。除此之外，周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間通過(guò)多種信號(hào)途徑相互作用共同調(diào)節(jié)血管形成、穩(wěn)定、重塑等[1]。Betsholtz[2]通過(guò)針對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的研究證實(shí)，應(yīng)用基因敲除的方法抑制周細(xì)胞的增殖、遷移、募集后，小鼠出現(xiàn)廣泛的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管擴(kuò)張、微血管瘤形成，于胚胎期死亡。還有研究發(fā)現(xiàn)：腫瘤血管幼稚化、不成熟、不穩(wěn)定等特征以及腫瘤細(xì)胞的血管轉(zhuǎn)移均與周細(xì)胞數(shù)量和周細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞比值下降有關(guān)[3]。

EMs被認(rèn)為是一種依賴(lài)于血管生成的疾病[6-7]，具有種植、侵襲、轉(zhuǎn)移等腫瘤生物學(xué)行為，同時(shí)有研究指出EMs的發(fā)生及發(fā)展程度同病灶局部的炎癥性反應(yīng)密切相關(guān)[8]，然而大量關(guān)于周細(xì)胞及血管生成的研究多局限于腫瘤和炎癥性疾病，周細(xì)胞在EMs血管生成中的研究卻鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示：無(wú)論EMs組在位內(nèi)膜還是對(duì)照組正常內(nèi)膜，分泌期內(nèi)膜MVD均高于增殖期內(nèi)膜，PN和PN/MVD則增殖期內(nèi)膜高于分泌期內(nèi)膜，表達(dá)隨月經(jīng)呈周期性改變，說(shuō)明子宮內(nèi)膜血管生成活躍時(shí)周細(xì)胞數(shù)量減少、周細(xì)胞覆蓋下降，驗(yàn)證了周細(xì)胞對(duì)維持血管成熟、穩(wěn)定的重要作用；異位內(nèi)膜MVD明顯高于對(duì)照組正常內(nèi)膜，進(jìn)一步證實(shí)了EMs是一種依賴(lài)于血管生成的疾病，豐富的血供是異位病灶的存活、生成的前提，也是EMs病灶發(fā)生出血、壞死等病變的基礎(chǔ)。異位內(nèi)膜的PN低于正常增殖期內(nèi)膜，與正常分泌期內(nèi)膜相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而異位內(nèi)膜的PN/MVD比值低于正常增殖期和分泌期內(nèi)膜，說(shuō)明同正常內(nèi)膜相比，特別是同血管增殖相對(duì)活躍的分泌期內(nèi)膜相比，異位內(nèi)膜中周細(xì)胞的總數(shù)無(wú)明顯差異，但是異位內(nèi)膜血管中平均每個(gè)微血管上的周細(xì)胞數(shù)減少，即周細(xì)胞覆蓋率降低，血管成熟度和穩(wěn)定性較差，更易發(fā)生異常增殖和出血，正如臨床所見(jiàn)EMs腹腔內(nèi)病灶往往變現(xiàn)為表面血管豐富，多呈分支、網(wǎng)狀、密集狀態(tài)，常伴有出血和壞死。

近年來(lái)有報(bào)道指出，腹腔鏡檢查顯示90%的女性經(jīng)期都會(huì)發(fā)生經(jīng)血逆流但是并非所有都發(fā)生EMs，故有學(xué)者提出了在位內(nèi)膜決定論[9]。同非EMs患者相比，EMs患者的在位內(nèi)膜黏附、侵襲、血管生成的能力均有明顯差異[10-11]。本研究中EMs患者在位內(nèi)膜同對(duì)照組正常內(nèi)膜比較結(jié)果顯示：2組之間同期別內(nèi)膜的MVD、PN均無(wú)明顯差異，但在位內(nèi)膜無(wú)論增殖期還是分泌期，PN/MVD均低于相應(yīng)的正常內(nèi)膜，說(shuō)明EMs患者的在位內(nèi)膜同正常組相比雖然MVD和PN無(wú)明顯不同，但周細(xì)胞覆蓋率較低，血管周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接減少，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用減弱，血管穩(wěn)定性較差，當(dāng)發(fā)生經(jīng)血逆流時(shí)更易在異地發(fā)生細(xì)胞遷移、增殖，誘導(dǎo)血管生成，這一結(jié)論同時(shí)也佐證了“在位內(nèi)膜決定論”。綜上，周細(xì)胞對(duì)EMs血管生成有重要作用，參與誘導(dǎo)血管生成啟動(dòng)、調(diào)節(jié)血管成熟、維持血管穩(wěn)定，周細(xì)胞覆蓋率是判定子宮內(nèi)膜血管成熟度和穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。提示以周細(xì)胞為靶點(diǎn)調(diào)節(jié)周細(xì)胞“正?；庇型蔀榭笶Ms血管生成治療的新途徑。

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（2013-09-02收稿 2013-12-23修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）

Roles of Pericyte in the Angiogenesis of Endometriosis

ZHAO Caiyun,YIN Lirong,SUN Junjie
Department of Gynaecology,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

Objective To study the expression of pericyte and the association between pericyte and angiogenesis in the endometriosis.Methodsthe endometriosis group is consisted of 20 ectopic endometrium,20 eutopic endometrium during proliferation phase,20 eutopic endometrium during secretory phase of patient with endometriosis.The control group (non-endometriosis)include 20 normal endometrium during proliferation phase and 20 normal endometrium during proliferation phase of women without entometriosis.The histological morphology parameters such as mean density of microvessel (MVD),pericytes number（PN）as well as the average ratio of pericyte to endothelial cells in microvessels were measured by immunohistochemical and morphological assesses.ResultsThe expression of MVD was lower in the normal endometrium and eutopic endometrium compared with it in ectopic endometrium tissue.The difference of the MVD among the different groups was statistical significant(P＜0.05).The expression of MVD in secretory phase endometrium was higher than it in proliferative phase endometrium(P＜0.05),and it shows no significant difference between eutopic endometrium and normal endometrium.The expression of PN and PN/MVD in ectopic and eutopic endometrium in EMs group were lower than those in control group.However,we also found that the difference of PN and PN/MVD was not statistically significant.ConclusionPericytes play an important role in angiogenesis of the endometriosis,and pericyte coverage contribute to maturing of functional vasculature of endometriosis.

endometriosis;neovascularization,physiologic;pericytes;immunohistochemistry;density of microvessel;angiogenesis

R711.71

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.008

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科（郵編300211）

△通訊作者 E-mail:yinlirongfk@sina.com