結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌患者外周血中Th17和Tc17細(xì)胞的變化

王建升 張立志 帖彥清 呂元鵬 宋津曉

結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌患者外周血中Th17和Tc17細(xì)胞的變化

王建升 張立志 帖彥清 呂元鵬 宋津曉

目的 檢測(cè)結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌患者外周血中輔助性T細(xì)胞（Th）17與殺傷性T細(xì)胞（Tc）17細(xì)胞比例的變化，并分析兩者的相關(guān)性。方法收集結(jié)直腸息肉17例、結(jié)直腸腺瘤34例和結(jié)直腸癌42例患者資料，另取17名健康志愿者為對(duì)照。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者和健康對(duì)照外周血中Th17和Tc17細(xì)胞比例；ELISA法檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素（IL）-17A和IL-23水平。結(jié)果結(jié)直腸腺癌組患者外周血中Th17和Tc17細(xì)胞比例以及IL-17A和IL-23水平最高，結(jié)直腸腺瘤及息肉組較高，對(duì)照組兩種細(xì)胞比例及兩因子水平最低，結(jié)直腸腺瘤組Tc17細(xì)胞比例高于結(jié)直腸息肉組，但兩組Th17細(xì)胞比例、IL-17A和IL-23水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析表明Th17和Tc17細(xì)胞呈正相關(guān)（rs=0.594）。結(jié)論在結(jié)直腸息肉或結(jié)直腸腺瘤向結(jié)直腸癌發(fā)展中，外周血Th17和Tc17細(xì)胞比例均明顯增多，且兩者呈正相關(guān)。

細(xì)胞因子類；結(jié)直腸息肉；結(jié)直腸腺瘤；結(jié)直腸癌；Th17細(xì)胞；Tc17細(xì)胞

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的一類腫瘤，其病因復(fù)雜，目前仍不清楚。有證據(jù)表明，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中大多會(huì)涉及機(jī)體的免疫細(xì)胞和免疫因子的異常[1-2]。輔助性T細(xì)胞（Th）17/殺傷性T細(xì)胞（Tc）17是一類由初始CD4+T/CD8+T細(xì)胞分化而來(lái)的效應(yīng)T細(xì)胞，它們參與了腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。目前，關(guān)于Th17和Tc17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-17A、IL-23在結(jié)直腸癌發(fā)展過(guò)程中的變化情況，國(guó)內(nèi)尚鮮見報(bào)道。本研究檢測(cè)結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌患者外周血中Th17和Tc17細(xì)胞比例變化，并檢測(cè)患者血清中IL-17A和IL-23水平的變化，旨在進(jìn)一步探討結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的免疫病理機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2010年6月—2012年12月結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸腺癌患者。所有患者的血標(biāo)本收集前均未行放射治療、化學(xué)治療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療。排除有癌家族史、自身免疫性疾病、感染性疾病、炎性腸病及家族性息肉者。所有患者均經(jīng)病理診斷證實(shí)且確定其病理類型。其中結(jié)直腸息肉組17例（結(jié)腸息肉9例，直腸息肉8例），男7例、女10例，平均年齡（62.2±8.4）歲；結(jié)直腸腺瘤組34例（結(jié)腸腺瘤20例，直腸腺瘤14例），男21例、女13例，平均年齡（65.2±9.1）歲；結(jié)直腸腺癌組42例（結(jié)腸腺癌18例，直腸腺癌24例），男20例、女22例，平均年齡（64.5±11.9）歲。選擇同期在我院進(jìn)行體檢的健康人群17例為健康對(duì)照組，男10例、女7例，平均年齡（63.6±9.4）歲。各組年齡（F=0.353）、性別（χ2=2.717）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有受試者均簽署知情同意書，并報(bào)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 Ficoll-Hypaque分離液購(gòu)自Sigma公司；佛波酯、離子霉素、布雷菲得菌素A、FIX&PERM Kit Reagent、鼠抗人CD3、CD8、IL-17A及其相應(yīng)的同型對(duì)照、IL-17A、IL-23酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒均購(gòu)自eBioscience公司。

1.3 標(biāo)本收集 所有受試對(duì)象于清晨抽取空腹外周血,其中4 mL置入肝素鈉抗凝管內(nèi)，F(xiàn)icoll-Hypaque液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）用于流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)；5 mL外周血離心后取血清儲(chǔ)存于-80℃以備分析IL-17A和IL-23用。

1.4 Th17和Tc17細(xì)胞流式檢測(cè) 分離的PBMCs以1×106/mL鋪于48孔培養(yǎng)板各孔中，每孔加入1 mg/L離子霉素和25 mg/L佛波酯各20 μL，然后加入10 mg/L布雷菲得菌素A 20 μL，于5%CO2孵箱37℃孵育5 h。用FITC標(biāo)記的鼠抗人CD8單抗和PE-Cy5標(biāo)記的鼠抗人CD3單抗進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，通過(guò)Reagent A固定、Reagent B破膜后再用PE標(biāo)記的抗人IL-17A單抗標(biāo)記胞內(nèi)抗體，0.5 mL 1%多聚甲醛PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用CellQuest分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。Th17細(xì)胞以CD3+、CD8-、IL-17+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的百分比表示；Tc17細(xì)胞以CD3+、CD8+、IL-17+T細(xì)胞在CD3+T細(xì)胞中的百分比表示。

1.5 ELISA檢測(cè)IL-17A和IL-23水平 收集所有受試對(duì)象的血清,用雙抗體夾心法進(jìn)行人IL-17A和IL-23的檢測(cè)。操作過(guò)程均按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；非正態(tài)數(shù)據(jù)用M(P25,P75)表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，2組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血中Th17和Tc17細(xì)胞比例變化 4組Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中結(jié)直腸腺癌組兩種細(xì)胞比例最高，健康對(duì)照組兩種細(xì)胞比例最低，結(jié)直腸腺瘤組Tc17細(xì)胞比例高于結(jié)直腸息肉組（P＜0.05），但2組Th17細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組外周血中IL-17A和IL-23水平變化 各組IL-17A和IL-23水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中結(jié)直腸腺癌組兩種因子水平均最高，健康對(duì)照組水平最低（P＜0.05），而結(jié)直腸息肉組和結(jié)直腸腺瘤組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Table 2 Comparison of the serum levels of IL-17A and IL-23 in healthy control groups and patient groups表2 各組血清中IL-17A和IL-23水平結(jié)果比較（μg/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）比較，b與（2）比較，c與（3）比較，P＜0.05

組別健康對(duì)照組（1）結(jié)直腸息肉組（2）結(jié)直腸腺瘤組（3）結(jié)直腸腺癌組（4）F n 17 17 34 42 IL-17A 4.65±2.59 7.19±3.67a7.50±3.81a12.89±11.94abc5.781＊＊IL-23 16.87±8.83 38.67±27.86a38.06±27.41a58.05±35.00abc8.862＊＊

2.3 各組外周血中Th17細(xì)胞、Tc17細(xì)胞、IL-17A和IL-23相關(guān)性分析 Th17和Tc17細(xì)胞呈正相關(guān)（rs=0.594）。Th17細(xì)胞與IL-17A（rs=0.829）和IL-23（rs=0.442）呈正相關(guān)。Tc17細(xì)胞與IL-17A（rs=0.337）和IL-23（rs=0.585）呈正相關(guān)（均P＜0.01）。

3 討論

3.1 Th17細(xì)胞在腫瘤中的變化 Th17細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類新型細(xì)胞亞群，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，在慢性炎癥、自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[5-6]，但對(duì)Th17細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用及意義目前尚不完全清楚。越來(lái)越多的證據(jù)表明,荷瘤小鼠和多種腫瘤患者的外周血、瘤組織、骨髓、脾等檢測(cè)到了高水平的Th17細(xì)胞[7]。進(jìn)一步分析表明，Th17細(xì)胞高水平并非腫瘤特異性的，在人卵巢癌晚期、胰腺癌及腎癌中也發(fā)現(xiàn)了Th17細(xì)胞的高表達(dá)，且相應(yīng)腫瘤組織中的Th17細(xì)胞隨著腫瘤的發(fā)展也逐漸增多[7]，表明Th17細(xì)胞高表達(dá)是腫瘤患者的一個(gè)普遍特征。但Th17細(xì)胞及其特征細(xì)胞因子IL-17A究竟是起促進(jìn)、還是抑制腫瘤的作用，目前仍存在爭(zhēng)議[8]。

3.2 Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A和IL-23介導(dǎo)的炎性反應(yīng)能誘導(dǎo)腸腺瘤和結(jié)腸癌的發(fā)生[8]。鼠腺瘤模型的瘤組織中存在異常增多的不能分泌IL-10的調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞，這種異常的Treg細(xì)胞不能有效地控制Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致腺瘤的發(fā)展[9]。在產(chǎn)生腸毒素的脆弱類桿菌（ETBF）引發(fā)的腸炎和結(jié)腸癌鼠模型中，ETBF能引發(fā)較強(qiáng)的Th17細(xì)胞炎性反應(yīng)，這種炎性反應(yīng)最終導(dǎo)致腸炎和結(jié)腸腫瘤的形成，但Tc17細(xì)胞在此過(guò)程中的作用不明顯[10]。IL-17A在“腺瘤→腺癌”順序中的腺瘤期就表達(dá)異常，其高表達(dá)與腸上皮不典型增生程度密切相關(guān)[11]。本研究表明，結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌患者外周血中Th17細(xì)胞比例均高于健康對(duì)照，從結(jié)直腸息肉或結(jié)直腸腺瘤到結(jié)直腸癌發(fā)展中，其數(shù)量明顯增多，其相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A和IL-23也呈現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)。相關(guān)性分析表明，Th17細(xì)胞與IL-17A、IL-23呈正相關(guān)，提示Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子IL-17A和IL-23可能參與了人結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的免疫病理過(guò)程。

3.3 Tc17細(xì)胞在腫瘤中的表達(dá) Tc17細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的又一類新型細(xì)胞亞群，其在感染性疾病和自身免疫性疾病中的研究頗多，但在腫瘤尤其是結(jié)直腸癌中的報(bào)道較少。胃癌患者外周血和腫瘤組織中的Tc17細(xì)胞隨著疾病的進(jìn)展而增加，且腫瘤組織中的Tc17細(xì)胞比例明顯高于外周血，高比例的Tc17細(xì)胞與胃癌患者的總生存期和無(wú)病生存期呈負(fù)相關(guān)，并可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)[12]。與健康人外周血相比，鼻咽癌患者外周血中有低比例Tc17細(xì)胞，而瘤組織則存在高比例Tc17細(xì)胞，這是因?yàn)門c17細(xì)胞能高表達(dá)趨化因子受體6（CCR6），而腫瘤組織高表達(dá)CC型趨化因子配體20（CCL20），后者能募集Tc17細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境中，致使患者外周血中的Tc17細(xì)胞數(shù)量減少[13]。本研究表明，結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌患者外周血中Tc17細(xì)胞比例都高于健康對(duì)照，從結(jié)直腸息肉到結(jié)直腸腺瘤再到結(jié)直腸癌，其數(shù)量逐漸增多。相關(guān)性分析表明，Tc17細(xì)胞不僅與IL-17A和IL-23呈正相關(guān)，而且與Th17細(xì)胞呈正相關(guān)。但結(jié)直腸腺瘤組Tc17細(xì)胞比例高于結(jié)直腸息肉組，而兩組Th17細(xì)胞比例無(wú)明顯差異，提示Tc17細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分化調(diào)控可能存在一些差異。

[1]Pellegrini P,Berghella AM,Del Beato T,et al．Disregulation in TH1 and TH2 subsets of CD4+T cells in peripheral blood of colorectal cancer patients and involvement in cancer establishment and progression[J]．Cancer Immunol Immunother,1996,42（1）: 1-8．

[2] Cui G,Florholmen J．Polarization of cytokine profile from Th1 into Th2 along colorectal adenoma-carcinoma sequence:implications for the biotherapeutic target[J]？ Inflamm Allergy Drug Targets, 2008,7（2）:94-97．

[3]Martinez GJ,Nurieva RI,Yang XO,et al．Regulation and function of proinflammatory TH17 cells[J]．Ann N Y Acad Sci,2008,1143: 188-211.doi:10.1196/annals.1443.021.

[4] Ciric B,El-behi M,Cabrera R,et al．IL-23 drives pathogenic IL-17-producing CD8+T cells[J]．J Immunol,2009,182（9）:5296-5305.doi:10.4049/jimmunol.0900036.

[5]謝兆蘭，周立云，王明林.CagA的表達(dá)對(duì)慢性胃炎Th細(xì)胞亞群分化的影響[J].天津醫(yī)藥,2013,41(8):752-755.

[6]徐三榮，周慶，韓博，等.全反式維甲酸抑制IL-23/IL-17通路促進(jìn)小鼠移植皮膚存活的研究[J].天津醫(yī)藥,2013,41(11):1099-1102.

[7]Kryczek I,Wei S,Zou L,et al．Cutting edge:Th17 and regulatory T cell dynamics and the regulation by IL-2 in the tumor microenvironment[J]．J Immunol,2007,178（11）:6730-6733．

[8]Wilke CM,Kryczek I,Wei S,et al．Th17 cells in cancer:help or hindrance[J]?Carcinogenesis,2011,32（5）:643-649.doi:10.1093/ carcin/bgr019.

[9] Gounaris E,Blatner NR,Dennis K,et al．T-regulatory cells shift from a protective anti-inflammatory to a cancer-promoting proinflammatory phenotype in polyposis[J].Cancer Res,2009,69（13）: 5490-5497.doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-0304.

[10]Wu S,Rhee KJ,Albesiano E,et al．A human colonic commensal promotes colon tumorigenesis via activation of T helper type 17 T cell responses[J]．Nat Med,2009,15（9）:1016-1022.doi:10.1038/ nm.2015.

[11]Shi Y,Lin H,Cui J,et al.The role of interleukin-17A in colorectal tumorigenesis[J].Cancer Biother Radiopharm,2013,28（6）:429-432.doi:10.1089/cbr.2012.1396.

[12]Zhuang Y,Peng LS,Zhao YL,et al．CD8（+）T cells that produce interleukin-17 regulate myeloid-derived suppressor cells and are associated with survival time of patients with gastric cancer[J]．Gastroenterology,2012,143（4）:951-962.e8.doi:10.1053/j.gastro.2012.06.010.

[13]Li J,Huang ZF,Xiong G,et al．Distribution,characterization,and induction of CD8+regulatory T cells and IL-17-producing CD8+T cells in nasopharyngeal carcinoma[J]．J Transl Med,2011,9:189. doi:10.1186/1479-5876-9-189.

（2013-07-18收稿 2013-12-06修回）

（本文編輯 李鵬）

The Changes of Circulating Th17 and Tc17 Cells in Patients with Colorectal Polyp, Adenoma and Cancer

WANG Jiansheng,ZHANG Lizhi,TIE Yanqing,LYU Yuanpeng,SONG Jinxiao
Clinical Laboratory，Hebei General Hospital,Hebei 050051,China

Objective To compare ratio of circulating Th17 over Tc17 cells in patients with colorectal polyp(CRP), colorectal adenoma(CRA)and colorectal cancer(CRC)，and analyse their relationship.MethodsThe ratio of circulating Th17 over Tc17 cells in 93 patients（17 CRP,34 CRA and 42 CRC）and 17 healthy donors were examined by flow cytometry; Serum levels of IL-17A and IL-23 were tested by ELISA.ResultsThe ratio of circulating Th17 over Tc17 cells and the serum levels of IL-17A and IL-23 were the lowest in healthy control groups,medium in CRP and CRA groups and the highest in CRC groups(P＜0.05).The proportions of Tc17 cells in CRA groups were significantly higher compared to those in CRP groups，but no statistical significance of proportion of circulating Th17 cells as well as serum levels of IL-17A and IL-23 between CRA and CRP groups was observed(P＞0.05).Further analysis showed that there was a positive correlation between proportions of circulating Th17 and Tc17 cells(rs=0.594,P＜0.001).ConclusionThe proportions of circulating Th17 and Tc17 cells were positively related and the ratio of Th17 over Tc17 was markedly increased from CRP group or CRA group to CRC group.

cytokines；colorectal polyp；colorectal adenoma；colorectal cancer；Th17 cells；Tc17 cells

R735.3

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.007

河北省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（郵編050051）