纖維支氣管鏡活檢組織Sox2基因?qū)Ψ伟┑脑\斷價(jià)值*

李勞冬 莫碧文△ 于會(huì)娜 王昌明 曾錦榮 王績(jī)英 李黨育

纖維支氣管鏡活檢組織Sox2基因?qū)Ψ伟┑脑\斷價(jià)值*

李勞冬1莫碧文1△于會(huì)娜2王昌明1曾錦榮1王績(jī)英1李黨育3

目的 探討纖維支氣管鏡活檢組織標(biāo)本中干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2 mRNA對(duì)肺癌的診斷價(jià)值。方法采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)100例肺癌患者和18例良性肺疾病患者纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本中Sox2 mRNA的表達(dá)，隨后利用免疫組化技術(shù)驗(yàn)證Sox2蛋白在50例肺癌組織、32例良性病變肺組織和18例癌旁正常肺組織間表達(dá)的差異，分析Sox2 mRNA表達(dá)與肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系及其在肺癌診斷中的潛在價(jià)值。結(jié)果Sox2 mRNA和蛋白在肺癌組織中的表達(dá)量顯著高于非癌肺組織（P＜0.05）。肺癌患者不同年齡、性別、病理類(lèi)型、TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移，Sox2 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sox2 mRNA ROC曲線下面積為0.748，臨界值取0.513時(shí)，其靈敏度和特異度分別為85.0%和61.1%。結(jié)論纖維支氣管鏡活檢組織標(biāo)本Sox2 mRNA可能是肺癌診斷的有效標(biāo)志物。

肺腫瘤；支氣管鏡檢查；腫瘤干細(xì)胞；腫瘤標(biāo)記，生物學(xué)；免疫組織化學(xué)；Sox2基因

Sox2是性別決定區(qū)Y框架蛋白(SRY-related HMG-box genes,Sox)家族中的重要一員，是胚胎干細(xì)胞維持其多潛能性的重要轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育的各階段中都起著關(guān)鍵性作用。研究表明，Sox2不僅在胚胎干細(xì)胞中表達(dá)，在乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌、食管癌、肺癌等人類(lèi)原發(fā)性腫瘤中也高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，是潛在的腫瘤診斷標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物[1]。纖維支氣管鏡檢查是目前臨床診斷肺癌的常規(guī)方法。然而，纖維支氣管鏡活檢組織中的Sox2 mRNA在肺癌中的診斷價(jià)值，及Sox2 mRNA的檢測(cè)可否輔助纖維支氣管鏡檢查目前國(guó)內(nèi)外尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)Sox2 mRNA和Sox2蛋白在肺癌和良性肺病變組織中的表達(dá)差異，探討纖維支氣管鏡活檢組織Sox2 mRNA在肺癌診斷中的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2011年1月—2012年1月桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和附屬南溪山醫(yī)院臨床病理資料完整的肺癌患者纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本100例。其中90例經(jīng)纖維支氣管鏡活檢病理確診為肺癌，另10例纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本并未見(jiàn)癌細(xì)胞，但經(jīng)肺穿刺、手術(shù)切除或纖維支氣管鏡刷片病理確診為肺癌。其中男84例，女16例，年齡29～80歲，平均（59.0±10.5）歲。非小細(xì)胞肺癌66例，其中鱗癌50例，腺癌16例；小細(xì)胞肺癌24例；其他類(lèi)型肺癌10例。根據(jù)2009年UICC肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期7例，Ⅱ期6例，Ⅲ期60例，Ⅳ期27例，其中85例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，15例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。收集同期良性肺疾病患者纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本18例，均無(wú)腫瘤證據(jù)，肺泡灌洗找到抗酸桿菌，經(jīng)抗感染（或抗結(jié)核）及對(duì)癥治療后臨床癥狀消失，胸片或肺部CT示病灶明顯吸收而確診為良性病變。其中支氣管炎7例，肺結(jié)核6例，肺炎3例，支氣管內(nèi)膜結(jié)核1例，支氣管擴(kuò)張1例。男14例，女4例，年齡23～73歲，平均（56.9±12.4）歲。2組間性別（χ2=0.094）、年齡（t=0.749）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另收集桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2002年1月—2012年12月病史資料完整的肺癌手術(shù)切除石蠟標(biāo)本50例，癌旁正常肺組織18例和良性病變肺組織32例行免疫組化檢測(cè)。肺癌組織中男38例，女12例；年齡34～76歲，平均（55.0±8.8）歲。小細(xì)胞肺癌7例，非小細(xì)胞肺癌43例，其中鱗癌23例，腺癌17例，支氣管肺泡細(xì)胞癌3例。癌旁正常肺組織中男12例，女6例；年齡48～73歲，平均（56.7±6.4）歲。良性病變肺組織中男23例，女9例；年齡23～72歲，平均（51.5±11.4）歲。3組間性別（χ2=0.734）、年齡（F=2.352）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有患者術(shù)前均未行放、化療，且術(shù)前均經(jīng)纖維支氣管鏡活檢。本研究通過(guò)桂林醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核，術(shù)前均告知患者本檢查的目的和取材方式，獲得患者的同意并簽知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑 Sox2（319 bp）引物：上游5′-GCT AGT CTC CAA GCG ACG AA-3′和下游5′-TAC AGT CTA AAA CTT TTG CCC TT-3′；內(nèi)參β-actin（417 bp）引物：上游5′-ACA GAG CCT CGC CTT TGC CGATC-3′，下游5′-TGG GTC ATC TTC TCG CGG TTG G-3′；均由上海invitrogen公司合成。Trizol總RNA抽提試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司。免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋，鼠抗人Sox2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)ProMab生物技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR檢測(cè)Sox2 mRNA的表達(dá) 活檢組織用DEPC水沖洗，置凍存管，立即放入液氮罐冷凍，再移至-80℃冰箱保存待用。取出纖維支氣管鏡活檢凍存標(biāo)本，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，嚴(yán)格按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取RNA；按照逆轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明將樣本mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進(jìn)入PCR擴(kuò)增；反應(yīng)體系（25 μL）：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×Mix 12.5 μL，加入RNase-free水至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56.2℃退火30 s（β-actin退火溫度為60.2℃），72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸2 min。配1.5%～2%瓊脂糖凝膠，取目的基因PCR產(chǎn)物6 μL和內(nèi)參PCR產(chǎn)物6 μL混勻后跑電泳，用JS-780凝膠成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，將每個(gè)標(biāo)本內(nèi)參設(shè)為1，以Sox2 mRNA條帶灰度值與其內(nèi)參（β-actin）條帶灰度值之比作為每例標(biāo)本Sox2 mRNA的表達(dá)量。

1.3.2 免疫組化檢測(cè)Sox2蛋白的表達(dá) 免疫組化染色嚴(yán)格按照PV-9000二步法免疫組化試劑盒說(shuō)明操作。抗原修復(fù)采用檸檬酸鹽緩沖液（0.01 mol/L pH6.0）高溫高壓修復(fù)，一抗稀釋濃度為1∶800。每批實(shí)驗(yàn)均采用已知Sox2陽(yáng)性的肺鱗癌組織切片為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：鏡下隨機(jī)讀取10個(gè)不重疊的高倍（400倍）視野，大約1 000個(gè)細(xì)胞被觀察分析。Sox2蛋白的表達(dá)依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞率及陽(yáng)性強(qiáng)度綜合計(jì)算其表達(dá)量。陽(yáng)性率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性，0分；1%～30%陽(yáng)性細(xì)胞，1分；31%～60%陽(yáng)性細(xì)胞，2分；60%以上陽(yáng)性細(xì)胞，3分。陽(yáng)性強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性，0分；淡黃色，1分；黃色或棕褐色，2分；深棕色，3分。陽(yáng)性表達(dá)水平得分=陽(yáng)性比例得分×陽(yáng)性強(qiáng)度得分，0分為陰性（-），1～2分為弱陽(yáng)性（+），3～6分為中度陽(yáng)性（++），7～9分為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（+++）。所有切片均由一位病理科醫(yī)師和一位訓(xùn)練良好的研究者在不了解患者臨床資料的情況下獨(dú)立觀察判斷，對(duì)獨(dú)立判斷不一致的病例再共同進(jìn)行觀察判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布計(jì)量資料以s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。不符合正態(tài)分布或方差不齊時(shí)以M(P25,P75)表示，采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。通過(guò)ROC曲線來(lái)評(píng)價(jià)Sox2 mRNA在肺癌中的診斷價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sox2 mRNA的表達(dá) Sox2 mRNA在肺癌纖維支氣管鏡活檢組織中的陽(yáng)性率為98%(98/100)，在良性肺病變的陽(yáng)性率為83.3%(15/18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.876，P＜0.05）。纖維支氣管鏡活檢肺癌組織Sox2 mRNA的灰度值為1.450(0.859,2.479)，良性肺病變組織為0.385(0.006,1.172)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=454.5，P=0.001）。

2.2 Sox2 mRNA的表達(dá)與肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 肺癌患者不同年齡、性別、病理類(lèi)型、TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移，Sox2 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.3 Sox2 mRNA在肺癌中的診斷價(jià)值 采用ROC曲線評(píng)價(jià)Sox2 mRNA對(duì)肺癌的診斷價(jià)值，Sox2 mRNA曲線下的面積為0.748，見(jiàn)圖1。臨界值取0.513時(shí)，其靈敏度和特異度分別為85.0%和61.1%。10例纖維支氣管鏡活檢病理檢查未見(jiàn)癌細(xì)胞的肺癌患者，其纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本Sox2 mRNA灰度值均大于0.513。

2.4 Sox2蛋白的表達(dá) Sox2陽(yáng)性蛋白顆粒主要定位于胞核，在所有正常肺組織和良性病變肺組織的支氣管上皮、鱗狀化生上皮均呈陽(yáng)性表達(dá)，在肺泡上皮呈陰性表達(dá)。Sox2在肺癌中的表達(dá)水平顯著高于正常肺組織（U=207.0）和良性病變肺組織（U=426.5），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2、圖2。

3 討論

隨著環(huán)境污染加重和人口老齡化程度加重，肺癌的發(fā)病率在我國(guó)呈不斷上升趨勢(shì)。盡管近幾十年來(lái)肺癌患者的預(yù)后有所改善，但其5年生存率只有16%[2]。早期診斷、早期手術(shù)切除是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵。纖維支氣管鏡檢查是肺癌診斷的常用檢查方法，包括纖維支氣管鏡鉗取活檢、纖維支氣管鏡細(xì)胞刷片和肺泡灌洗等。即使常規(guī)的纖維支氣管鏡檢查聯(lián)合運(yùn)用，其診斷肺癌的敏感度也只有90%[3]。近來(lái)，Maldonado等[4]認(rèn)為，通過(guò)先進(jìn)的分子技術(shù)可輔助常規(guī)的纖維支氣管鏡標(biāo)本病理診斷，從而篩查和早期診斷肺癌。

Sox2是胚胎干細(xì)胞維持其多潛能性的重要轉(zhuǎn)錄因子，在維持食管、支氣管的正常發(fā)育及神經(jīng)干細(xì)胞、肺支氣管基底細(xì)胞的干細(xì)胞特性方面發(fā)揮著重要作用，是重要的干細(xì)胞標(biāo)志物。Sanada等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Sox2在胰腺導(dǎo)管內(nèi)瘤變、原位癌和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)呈逐漸增加的趨勢(shì)，且其高表達(dá)在低分化胰腺癌和血管浸潤(rùn)性胰腺癌中更明顯，提示Sox2可能參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。最近，有報(bào)道稱(chēng)Sox2在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，是判斷胃癌患者預(yù)后不佳的標(biāo)志物[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，沉默Sox2可顯著抑制膠質(zhì)腦細(xì)胞瘤的細(xì)胞克隆增殖能力和體內(nèi)成瘤能力，Sox2是治療膠質(zhì)腦細(xì)胞瘤有效的作用靶點(diǎn)[7]。Lu等[8]觀察到Sox2在人類(lèi)原發(fā)性肺鱗癌和部分肺腺癌中高表達(dá)，Sox2的高表達(dá)可誘導(dǎo)遠(yuǎn)端氣道產(chǎn)生近端氣道樣化生并引起腫瘤，Sox2的高表達(dá)參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。Chapman等[9]則發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)血液標(biāo)本中的Sox2自身抗體是診斷小細(xì)胞肺癌的有效指標(biāo)，有助于對(duì)小細(xì)胞肺癌高危人群進(jìn)行早期診斷。

本研究顯示Sox2 mRNA和蛋白在肺癌中的表達(dá)顯著高于非癌肺組織，提示Sox2基因在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，可能在肺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。利用免疫組化技術(shù)，筆者觀察到Sox2蛋白在非癌肺組織中主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞和鱗狀化生支氣管上皮細(xì)胞，與以往研究結(jié)果相符[8,10]。這些Sox2陽(yáng)性的支氣管上皮細(xì)胞可能通過(guò)惡性突變參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展。一般認(rèn)為，Sox2在肺癌中的表達(dá)與組織類(lèi)型有關(guān)，Sox2在肺鱗癌中的表達(dá)顯著高于肺腺癌。本研究發(fā)現(xiàn)，不同年齡、性別、病理類(lèi)型、TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移肺癌患者，Sox2 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本的異質(zhì)性有關(guān)，由于纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本體積小，癌細(xì)胞比例低及標(biāo)本中包含或多或少的支氣管上皮細(xì)胞和鱗狀化生上皮細(xì)胞，從而干擾了Sox2 mRNA在肺癌患者纖維支氣管鏡活檢組織中的表達(dá)與肺癌的臨床病理參數(shù)的關(guān)系。筆者發(fā)現(xiàn)ROC曲線下的面積為0.748，提示其在肺癌中具有較高的診斷價(jià)值。此外，本研究10例纖維支氣管鏡活檢病理檢查假陰性的肺癌患者，其纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本Sox2 mRNA灰度值均大于0.513。提示此種情況，即使纖維支氣管鏡活檢常規(guī)病理檢查未見(jiàn)癌細(xì)胞，仍高度懷疑為肺癌，必要時(shí)需行肺穿刺活檢或手術(shù)切除肺活檢明確診斷。檢測(cè)纖維支氣管鏡活檢組織標(biāo)本Sox2 mRNA的表達(dá)或許可輔助常規(guī)纖維支氣管鏡檢查。而可否通過(guò)檢測(cè)纖維支氣管鏡細(xì)胞刷片或肺泡灌洗液或血液標(biāo)本中Sox2 mRNA的表達(dá)來(lái)篩查和早期診斷肺癌需進(jìn)一步研究予證實(shí)。

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（2013-06-19收稿 2013-10-27修回）

（本文編輯 魏杰）

The Diagnostic Value of Sox2 mRNA Transcription Level in Bronchoscopy Biopsy Specimens in Lung Cancer

LI Laodong1,MO Biwen1,YU Huina2,WANG Changming1,ZENG Jinrong1,WANG Jiying1,LI Dangyu3
1 Department of Respiratory Medicine,Hospital Affiliated Guilin Medical College,Guilin 541001,China;2 Department of Pediatrics,Jingzhou Central Hospital of Hubei Province;3 Department of Respiratory Medicine,Nan Xi Shan Hospital

ObjectiveTo study the diagnostic value of Sox2 mRNA transcription level in bronchoscopic biopsy specimens from lung cancer patients.MethodsThe expression of Sox2 mRNA was detected using RT-PCR from 100 human lung cancer biopsy and 18 non-cancer lung biopsy through bronchoscopy.The expression of Sox2 protein was examined by immunohistochemistry from 50 cases of lung cancer biopsy,32 cases of benign lung lesions and 18 cases of pericarcinomatous normal lung tissues.Then the relationships between Sox2 mRNA transcription level and lung cancer clinical pathological parameters were analyzed to test the diagnostic value of Sox2 transcription level.ResultsThe transcription of Sox2 mRNA and its protein expression level were significantly higher in lung cancer than that in benign pulmonary disease tissues（P＜0.05）.The transcription of Sox2 mRNA was not correlated with age,gender,histology,lymph node metastasis,TNM stage and differentiation of lung cancer patients(P＞0.05).The Sox2 mRNA yielded an area of 0.748 under the ROC curve with the sensitivity of 85.0%and the specificity of 61.1%,taking the cut-off value of 0.513.ConclusionThe Sox2 mRNA might be a useful diagnostic marker for lung cancer.

lung neoplasm;bronchoscopy;neoplastic stem cells;tumor markers,biological;immunohistochemistry; Sox2 gene

R734.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.004

*廣西衛(wèi)生廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：重2012003，重2011008，重2010046）

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科（郵編541001）；2荊州市中心醫(yī)院兒科；3南溪山醫(yī)院呼吸內(nèi)科

△通訊作者 E-mail:mobiwen2002@sohu.com