siRNA抑制Mcl-1基因表達對胃癌細胞MGC-803生物學行為的影響*

劉金祿 王 震 陳俊強 崔希剛 馬鵬飛 黎伯培

siRNA抑制Mcl-1基因表達對胃癌細胞MGC-803生物學行為的影響*

劉金祿 王 震 陳俊強△崔希剛 馬鵬飛 黎伯培

目的 探討siRNA抑制Mcl-1基因表達后對胃癌細胞MGC-803生物學行為的影響。方法合成針對Mcl-1的靶向siRNA（Mcl-1 siRNA組），以空白細胞（空白對照組）和分別轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體試劑（脂質(zhì)體對照組）及陰性對照siRNA（陰性對照組）作為對照組。噻唑藍（MTT）實驗檢測Mcl-1 siRNA對MGC-803細胞增殖能力的影響；流式細胞術觀察各組細胞凋亡及周期變化情況；轉(zhuǎn)染48 h后應用Transwell小室分析細胞侵襲、遷移能力的變化。結(jié)果Mcl-1 siRNA組轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h的A值低于3個對照組（P＜0.05），其細胞增殖抑制率分別為8.9%、21.6%和18.8%。轉(zhuǎn)染48 h后，Mcl-1 siRNA組細胞凋亡率高于空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組（%：19.61±1.66 vs 3.69±0.37 vs 3.54±0.47 vs 3.68±0.55，F(xiàn)=12.230，P＜0.05）。Mcl-1 siRNA組G0/G1[（41.03±1.86）%]、G2/M期[（1.80±0.46）%]比例均低于3個對照組，S期比例[（57.17±1.72）%]高于3個對照組（均P＜0.05）。Mcl-1 siRNA組侵襲、遷移實驗中的穿膜細胞數(shù)（分別是42.00±4.00、76.33±3.51）均低于空白對照組（分別是79.33±3.51、108.00±3.61）、脂質(zhì)體對照組（分別是74.67±2.52、110.67±4.04）和陰性對照組（分別是77.33±3.06、109.33±4.51）。以上指標在3個對照組間差異均無統(tǒng)計學意義。結(jié)論抑制Mcl-1表達可有效降低胃癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，并促進腫瘤細胞凋亡。

胃腫瘤；RNA,小分子干擾；細胞增殖；細胞凋亡；細胞侵襲；細胞遷移；siRNA；髓樣細胞白血病-1基因

髓樣細胞白血病-1(myeoid cell leukemin-1, Mcl-1)基因是Bcl-2基因家族的一員[1]，有研究指出降低Mcl-1的表達可抑制腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞的凋亡并導致其細胞周期阻滯[2-3]。但目前有關抑制Mcl-1基因表達對胃癌細胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移能力等方面影響的研究仍較少。本研究前期研究發(fā)現(xiàn)，低分化胃癌細胞株MGC-803中存在Mcl-1的高表達。本研究在此基礎上探討Mcl-1對胃癌細胞MGC-803生長、侵襲轉(zhuǎn)移、細胞凋亡及細胞周期的影響，以期進一步明確其與胃癌發(fā)生發(fā)展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞株MGC-803購自中國科學院上海細胞所；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；標準胎牛血清購自美國HyClone公司；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體購自美國invitrogen公司；細胞凋亡和細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基公司；纖維粘連蛋白（FN）購自美國Solarbio公司；Matrigel膠購自美國BD公司；噻唑藍（MTT）購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國CORNING公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA合成 根據(jù)Mcl-1（NM_021960）基因信息利用siRNA Designer System按照siRNA干擾片段的設計原則設計siRNA序列，送上海吉瑪公司合成，前期實驗篩選出有效片段，正義鏈5′-GCA GGA UUG UGA CUC UCA UTT-3′，反義鏈5′-AUG AGA GUC ACA AUC CUG CTT-3′；同時合成FAM標記的陰性對照，正義鏈5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，反義鏈5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。

1.2.2 實驗分組與轉(zhuǎn)染 實驗設4組。（1）空白對照組：未進行任何轉(zhuǎn)染的胃癌細胞MGC-803。（2）脂質(zhì)體對照組：轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體。（3）陰性對照組：轉(zhuǎn)染陰性對照序列。（4）Mcl-1 siRNA組：轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA干擾序列。分別按脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說明書于96孔板進行瞬時轉(zhuǎn)染，每組設5個復孔。

1.2.3 胃癌細胞增殖能力檢測 參照文獻[4]進行胃癌細胞增殖能力檢測。分別取轉(zhuǎn)染后0 h（轉(zhuǎn)染時間點）、24 h、48 h、72 h的各組胃癌細胞，向每孔加5 g/L MTT溶液20 μL；避光在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。每孔加DMSO100 μL，避光振蕩充分溶解結(jié)晶物。用酶標儀測定光吸收（A）值，測定波長為570 nm；繪制生長曲線。細胞增殖抑制率(%)=（A空白對照組-AMcl-1siRNA組）/A空白對照組×100%。

1.2.4 胃癌細胞凋亡檢測 收集轉(zhuǎn)染后48 h的細胞，調(diào)整細胞個數(shù)到（1～5）×105個并制成懸浮細胞，先加入5 μL AnnexinV-FITC混勻，再加入5 μL PI混勻。室溫、避光反應5～15 min；在1 h內(nèi)用激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm的流式細胞儀觀察和檢測。

1.2.5 胃癌細胞周期分布檢測 分別取轉(zhuǎn)染后48 h的各組胃癌細胞制成細胞懸液，并調(diào)整細胞濃度至1×106/mL。加入400 μL PI染色，流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，用620 nm波長濾器檢測紅色熒光，收集數(shù)據(jù)用MultiCycle分析軟件進行細胞周期的分析，分別計算G0/G1期、S期和G2/M期細胞的相對比例。

1.2.6 胃癌細胞侵襲及遷移能力檢測 按照Transwell及Matrigel說明書操作。侵襲實驗于Transwell小室涂抹纖維粘連蛋白和Matrigel膠構建基底膜，遷移實驗不構建基底膜。分別取轉(zhuǎn)染后48 h的各組胃癌細胞制成2×105/mL的細胞懸液，取100 μL加入Transwell小室，培養(yǎng)24 h后擦去上室內(nèi)的細胞，結(jié)晶紫染色后正置顯微鏡觀察3～5個視野計數(shù)取均值，計算穿膜細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Mcl-1 siRNA對胃癌細胞增殖的影響 除轉(zhuǎn)染后0 h各組A值差異無統(tǒng)計學意義外，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h Mcl-1 siRNA組A值均低于空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組（均P＜0.05），空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組3組間A值比較差異無統(tǒng)計學意義，見表1。Mcl-1 siRNA組轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h的細胞增殖抑制率分別為8.9%、21.6%和18.8%。

Table 1 Time effect of siRNA interference on MGC-803 cell growth表1 各組siRNA干擾后不同時點A值比較（n=3±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Mcl-1 siRNA組比較，P＜0.05；表2、3同

組別空白對照組脂質(zhì)體對照組陰性對照組Mcl-1 siRNA組F 0 h 0.510±0.010 0.504±0.007 0.515±0.008 0.516±0.008 0.851 24 h 0.952±0.018a0.939±0.026a0.950±0.016a0.867±0.027 19.965＊48 h 1.557±0.022a1.529±0.026a1.545±0.039a1.220±0.051 110.481＊＊72 h 2.153±0.052a2.064±0.059a2.063±0.060a1.748±0.013 168.835＊＊

2.2 Mcl-1 siRNA對胃癌細胞凋亡的影響 Mcl-1 siRNA組細胞凋亡率（19.61±1.66）%明顯高于空白對照組（3.69±0.37）%、脂質(zhì)體對照組（3.54±0.47）%和陰性對照組（3.68±0.55）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=12.230，P＜0.05），而空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義，見圖1。

2.3 Mcl-1 siRNA對胃癌細胞周期的影響 轉(zhuǎn)染48 h后各組MGC-803細胞中細胞周期的分布情況見圖2。Mcl-1 siRNA組G0/G1、G2/M期比例均低于空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組，S期比例高于空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組（均P＜0.05）。空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組細胞周期分布差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

2.4 Mcl-1 siRNA對胃癌細胞侵襲、遷移能力的影響 Mcl-1 siRNA組侵襲、遷移實驗中的穿膜細胞數(shù)均低于空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組間比較差異均無統(tǒng)計學意義，見表3、圖3、4。

Table 2 MGC-803 cell cycle distribution of each group表2 各組MGC-803細胞周期分布比較（n=3，%±s）

組別空白對照組脂質(zhì)體對照組陰性對照組Mcl-1 siRNA組F G0/G1期64.00±2.29a65.90±2.85a67.30±2.48a41.03±1.86 269.898＊＊S期25.40±0.85a26.03±1.10a24.63±1.01a57.17±1.72 921.818＊＊G2/M期10.60±1.49a8.07±1.76a8.07±1.48a1.80±0.46 11.066＊

Table 3 Comparing cell invasion and migration ability in different groups表3 各組細胞侵襲、遷移能力（穿膜細胞數(shù)）比較（n=3，個s）

組別空白對照組脂質(zhì)體對照組陰性對照組Mcl-1 siRNA組F侵襲能力79.33±3.51a74.67±2.52a77.33±3.06a42.00±4.00 30.941＊＊遷移能力108.00±3.61a110.67±4.04a109.33±4.51a76.33±3.51 17.459＊

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位居所有腫瘤的第2位；我國是胃癌高發(fā)的國家，其發(fā)病率位居各類腫瘤前列[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)Mcl-1蛋白在胃癌組織中的表達明顯高于非癌胃黏膜組織，并且與腫瘤的T分期、臨床分期、腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和血管浸潤密切相關[7-9]。在晚期胃癌特別是侵犯漿膜的胃癌中Mcl-l蛋白的表達較高[10]。對胃癌細胞株的研究發(fā)現(xiàn)，Mcl-1蛋白在多種胃癌細胞系中高表達，且其表達明顯高于正常胃黏膜細胞系[7,11]。由此提示Mcl-1的表達與胃癌的發(fā)生發(fā)展有著重要的關系。研究表明，Mcl-1也可調(diào)節(jié)胃癌細胞的周期，影響胃癌細胞的凋亡[11]。但其與胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移關系的研究多在胃癌組織中進行。

本研究采用基因沉默技術抑制低分化胃癌細胞株MGC-803中Mcl-1基因的表達，觀察胃癌細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化及其對胃癌細胞凋亡和周期分布的影響。結(jié)果顯示，Mcl-1 siRNA組轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h的A值均低于空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組，而空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組間無明顯差異，提示抑制Mcl-1表達可以有效抑制胃癌細胞的增殖。Mcl-1 siRNA組轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h的細胞增殖抑制率分別為8.9%、21.6%和18.8%，以轉(zhuǎn)染后48 h最高，但其是否與瞬時轉(zhuǎn)染的不穩(wěn)定性有關，有待穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進一步檢測。本研究結(jié)果顯示，抑制Mcl-1的表達后，Mcl-1 siRNA組細胞凋亡率明顯高于空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組，且細胞周期以停滯在S期居多。這與Akagi等[11]的研究結(jié)果一致。

在本研究的侵襲、遷移實驗中，Mcl-1 siRNA組穿膜細胞數(shù)低于空白對照組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組，提示抑制Mcl-1基因的表達可以降低MGC-803細胞的侵襲、遷移能力。從細胞水平進一步證實了研究者們通過臨床標本得出的Mcl-1與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相關的結(jié)論，為明確Mcl-1與胃癌細胞侵襲、遷移能力之間的關系提供了更為直接有力的證據(jù)。但本實驗只是應用脂質(zhì)體介導的Mcl-1特異性siRNA的胃癌細胞的瞬時轉(zhuǎn)染，抑制狀態(tài)不夠穩(wěn)定；另外，未進行動物實驗，無法明確其在體內(nèi)的作用情況，故Mcl-1影響胃癌發(fā)展的作用機制有待于進一步研究。

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（2013-08-07收稿 2013-12-19修回）

（本文編輯 陳麗潔）

The Effect of Silencing Mcl-1 by siRNA on Biological Behavior of Gastric Cancer MGC-803 Cell

LIU Jinlu,WANG Zhen,CHEN Junqiang,CUI Xigang,MA Pengfei,LI Bopei
Department of Gas trointestinal Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021，China

Objective To investigate the effect of inhibiting Mcl-1 gene expression on the biological behavior of gastric cancer cell MGC-803 by using a small interference RNA(siRNA).MethodsSynthesized siRNA targeting Mcl-1(Mcl-1 siRNA group)was transfected into MGC-803 cells.On the other hand,MGC-803 cells transfected with negative siRNA (Mcl-1siRNA-NC group),MGC-803 cells transfected with Lipofectamine 2000（liposomes control group）and vacant MGC-803 cells（blank control group）were used as controls.Proliferation of MGC-803 cells after transfection of Mcl-1 siRNA was investigated by MTT assay.After 48 h transfection of Mcl-1 siRNA,flow cytometry(FCM)was used to examine the apoptosis cells and cell cycle in all four groups.Polycarbonate membrane transwell chamber was used for evaluating the invasion and migration of the cell line.ResultsThe absorbance of MGC-803 cells decreased greatly after transfected with Mcl-1siRNA for 24、48 and 72 h compared to those in control groups(P＜0.05);After transfected 48 h,apoptosis rate in Mcl-1siRNA group was higher than in the blank control group,liposomes control group and Mcl-1siRNA-NC group(%:19.61±1.66 vs 3.69±0.37 vs 3.54±0.47 vs 3.68±0.55,F=12.230,P＜0.05),G0/G1[(41.03±1.86)%]and G2/M phase ratio[(1.80±0.46)%] in Mcl-1 siRNA group were lower than in the three control groups,S phase ratio[(57.17±1.72)%]in siRNA group was higher than in three control groups(P＜0.05). The number of transmembrane cells in Mcl-1 siRNA group in polycarbonate membrane transwell chamber experiment(42.00±4.00,76.33±3.51 respectively)were less than in blank control group(79.33±3.51,108.00±3.61 respectively),liposome control group(74.67±2.52,110.67±4.04 respectively)and negative control group (77.33±3.06,109.33±4.51 respectively).However,there was no significant difference in above index among the control groups.ConclusionInhibitiing Mcl-1 expression can effectively suppress growth,invasion and migration,but promote apoptosis in gastric cancer cells.

stomach neoplasms;RNA,small interfering;cell proliferation;apoptosis;cell invasion;cell migration; siRNA;myeoid cell leukemin-1 gene

R735.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.003

*廣西自然科學基金資助項目(項目編號:桂科自0832113)；廣西教育廳科研資助項目（項目編號：201012MS062）；廣西衛(wèi)生廳重點課題資助項目（項目編號：重2012067）；廣西自然科學基金資助項目(項目編號:2012GXNSFDA239001)

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科（郵編530021）

△通訊作者 E-mail:gxhans@163.com