人胰島素原基因突變導(dǎo)致糖尿病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究*

張紅艷 崔景秋 李 寧 劉 銘 馮 憑

人胰島素原基因突變導(dǎo)致糖尿病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究*

張紅艷 崔景秋△李 寧 劉 銘 馮 憑

目的 構(gòu)建幾種與人類(lèi)糖尿病相關(guān)的人突變型胰島素原質(zhì)粒，并在大鼠胰島素瘤細(xì)胞（INS-1）中進(jìn)行表達(dá)。方法以野生型人胰島素原質(zhì)?；騊CMS-EGFP/HWT為模板，設(shè)計(jì)并合成引物，利用定點(diǎn)突變技術(shù)，PCR生成PCMS-EGFP/H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C、H-F(B25)L 4種單點(diǎn)突變質(zhì)粒，對(duì)每個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定驗(yàn)證定點(diǎn)突變成功，用脂質(zhì)體2000將上述野生型、4種突變型質(zhì)粒及空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞，放射免疫法檢測(cè)各細(xì)胞培養(yǎng)液中人胰島素水平。結(jié)果序列測(cè)定證實(shí)上述質(zhì)粒定點(diǎn)突變成功,H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C 3組突變細(xì)胞培養(yǎng)液中胰島素水平低于野生型和H-F(B25)L組（P＜0.05），與空質(zhì)粒組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且3組彼此間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；H-F(B25)L組與野生型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論成功構(gòu)建并表達(dá)4種突變型人胰島素原質(zhì)粒，不同突變型胰島素原可能通過(guò)不同機(jī)制導(dǎo)致糖尿病。

誘變,定點(diǎn)；質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；永久性新生兒糖尿病；胰島素原錯(cuò)誤折疊；β細(xì)胞功能衰竭

胰島素病是指由胰島素編碼序列中的單基因突變所引起的一系列嚴(yán)重的常染色體顯性遺傳性疾病。其中大多數(shù)胰島素病患者對(duì)外源胰島素很敏感，具體機(jī)制尚不清楚，臨床診斷中常常隱匿在1B型糖尿病（抗體陰性）、青少年發(fā)病的成年型糖尿?。∕ODY）及非肥胖的早發(fā)2型糖尿病中[1]。由于不同胰島素基因突變引起的臨床特征及其對(duì)胰島素分泌水平的影響不同，目前研究認(rèn)為不同類(lèi)型的突變可能是通過(guò)不同的機(jī)制導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)（site-directed mutagenesis）構(gòu)建3種導(dǎo)致永久性新生兒糖尿?。╬ermanent neonatal diabetes mellitus，PND）以及1種導(dǎo)致成年發(fā)病的突變型人胰島素原質(zhì)粒，在大鼠胰島素瘤細(xì)胞（INS-1）中成功表達(dá)，并檢測(cè)各自細(xì)胞培養(yǎng)液中的胰島素水平，旨在探索單基因突變導(dǎo)致的糖尿病發(fā)病的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 PCMS-EGFP/HWT質(zhì)粒為本課題組劉銘教授構(gòu)建保存；INS-1細(xì)胞由天津市心血管病研究所惠贈(zèng)（購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)）。高純度質(zhì)粒中量提取試劑盒Plasmid Midi Kit購(gòu)自QIAGEN公司；定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自北京全式金公司；引物由奧科生物有限公司合成；脂質(zhì)體2000購(gòu)自Invitrogen公司。人胰島素放免試劑盒購(gòu)自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增突變型胰島素原 以野生型胰島素原質(zhì)?；騊CMS-EGFP/HWT為模板，應(yīng)用定點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行PCR，突變位點(diǎn)分別為B19位氨基酸由C突變?yōu)镚，B11位氨基酸由L突變?yōu)镻，S6位氨基酸由R突變?yōu)镃，B25位氨基酸由F突變?yōu)長(zhǎng)，分別針對(duì)4個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物并合成。PCR反應(yīng)體系如下：5×Buffer 10 μL，質(zhì)粒模板DNA 1 μL（6 ng），10 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物各1 μL（80 mg/L），DNA聚合酶1 μL補(bǔ)水至50 μL，瞬時(shí)離心混勻，循環(huán)參數(shù)為94℃4 min，后94℃30 s，55℃30 s，72℃150 s，25個(gè)循環(huán)，72℃10 min。PCR產(chǎn)物DMT酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，見(jiàn)表1、2。

1.2.2 INS-1細(xì)胞培養(yǎng)及突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 INS-1細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640（含0.11 g/L L-谷胱甘肽+ 0.11 g/L丙酮酸鈉+5.6 mmol/L葡萄糖+1 mL/L 2-巰基乙醇），將細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板并置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用脂質(zhì)體2000將突變型胰島素原質(zhì)粒、野生型質(zhì)粒及空質(zhì)粒PCMC-EGFP分別轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞，各質(zhì)粒和脂質(zhì)體2000比例為每孔2 μg∶3 μL。轉(zhuǎn)染48 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)，并收集細(xì)胞培養(yǎng)液，-20℃凍存。

1.2.3 人胰島素水平的檢測(cè) 分別將空質(zhì)粒對(duì)照、野生型胰島素原質(zhì)粒、突變型胰島素原質(zhì)粒轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，應(yīng)用放射免疫法檢測(cè)人胰島素水平，試劑盒購(gòu)自Millipore公司，與鼠胰島素?zé)o交叉反應(yīng)，不識(shí)別內(nèi)源性的大鼠胰島素。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 點(diǎn)突變質(zhì)粒的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，與野生型胰島素原質(zhì)粒一致，4種點(diǎn)突變質(zhì)粒均于5.7 kb處可見(jiàn)清晰條帶，見(jiàn)圖1。分別對(duì)4種突變型質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，并與野生型胰島素原質(zhì)粒序列對(duì)比，突變位置正確。

2.2 INS-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果 轉(zhuǎn)染48 h后可見(jiàn)INS-1細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)基本正常，狀態(tài)良好。轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠熒光蛋白（GFP）顆粒，48 h后細(xì)胞中GFP表達(dá)呈片狀，表明轉(zhuǎn)染成功，各組轉(zhuǎn)染效率接近，見(jiàn)圖2。

2.3 INS-1細(xì)胞培養(yǎng)液中人胰島素水平檢測(cè)結(jié)果 H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C 3組突變細(xì)胞培養(yǎng)液中胰島素水平低于野生型和H-F(B25)L組（P＜0.05），與空質(zhì)粒組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且3組彼此間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；H-F(B25)L組與野生型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 胰島素基因突變型糖尿病研究現(xiàn)狀 根據(jù)臨床特征將胰島素病分為青少年型糖尿?。∕IDY），以及成年發(fā)病型糖尿病。其中MIDY是一種新型的單基因突變型糖尿病[2]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與MIDY有關(guān)的胰島素基因突變有26個(gè)，其中22個(gè)突變都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素缺乏性糖尿病。MIDY突變已經(jīng)被認(rèn)為是PND的常見(jiàn)病因[3]，突變位置包括半胱氨酸、非半胱氨酸（包含信號(hào)肽），不同位置突變導(dǎo)致糖尿病發(fā)病年齡和病情輕重不同，因此推測(cè)發(fā)病機(jī)制可能不同。

Table 3 Comparison of human insulin values in culture solution表3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中人胰島素水平比較（mIU/L±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，P＜0.05

組別PCMS-EGFP/H-F(B25)L（1）PCMS-EGFP/HWT（2）PCMS-EGFP/H-C(B19)G（3）PCMS-EGFP/H-L(B11)P（4）PCMS-EGFP/H-R(S6)C（5）PCMS-EGFP空質(zhì)粒（6）F n666666胰島素值23.41±0.99 23.74±1.20 4.72±0.05ab4.71±0.16ab4.59±0.31ab4.61±0.24ab1 322.002＊＊

3.2 半胱氨酸突變導(dǎo)致糖尿病機(jī)制分析 本研究中H-C(B19)G突變是B鏈19位由半胱氨酸突變?yōu)楦拾彼幔蛔兛赡苡绊懥薆19-A20分子內(nèi)二硫鍵的形成，造成胰島素原錯(cuò)誤折疊，影響胰島素原的轉(zhuǎn)運(yùn)、加工和分泌，因此其細(xì)胞培養(yǎng)液中胰島素水平明顯降低。同時(shí)大量錯(cuò)誤折疊的胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)堆積，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplastic reticulum stress，ESR）和胰島β細(xì)胞的凋亡。國(guó)外研究也證實(shí)C(A7) Y、C(B19)G、S(A12)C、G(B8)S、H-C(B19)G等突變影響二硫鍵的形成，患者多在新生兒期發(fā)病，表現(xiàn)為嚴(yán)重的胰島素依賴性糖尿病，此類(lèi)突變改變了胰島素原肽鏈上半胱氨酸殘基的數(shù)量，影響胰島素原分子內(nèi)部正常二硫鍵的形成[4]。對(duì)胰島素原分子動(dòng)力學(xué)的研究也提示，在還原條件下，胰島素原二硫鍵打開(kāi)，造成B鏈中心螺旋穩(wěn)定性破壞，胰島素原整體空間構(gòu)象改變，生物活性受損[5]。

3.3 非半胱氨酸突變導(dǎo)致糖尿病機(jī)制分析 H-L (B11)P為非半胱氨酸突變，此類(lèi)突變沒(méi)有改變半胱氨酸殘基的數(shù)量，但它們?cè)谝葝u素原分子中的定位對(duì)于二硫鍵的正確配對(duì)以及維持二硫鍵的穩(wěn)定至關(guān)重要，突變?cè)斐梢葝u素原的錯(cuò)誤折疊，因此分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中的胰島素明顯低于野生型。H-R(S6)C/ H突變?cè)谛∈笠葝uβ細(xì)胞瘤（MIN6）細(xì)胞中的研究提示，突變?cè)斐奢p微的ERS，對(duì)胰島素原的靶向胞吐作用影響不大，臨床發(fā)病年齡較晚，病情較輕，常誤診斷為MODY[6]。本研究中H-R(S6)C突變后細(xì)胞培養(yǎng)液中胰島素水平減低，提示突變后胰島素未被轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，原因可能是突變影響了信號(hào)肽的剪切，繼而影響了下一步的正確折疊。Liu等[7]研究證實(shí)，同為信號(hào)肽位置突變，A(S23)S突變并未影響信號(hào)肽剪切，而A(S24)D突變?cè)斐杉羟形稽c(diǎn)改變，錯(cuò)誤剪切的胰島素原大量堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，引起ERS。2013年最新報(bào)道的L(S13)R突變，定位研究顯示此突變位于胰島素原信號(hào)肽的疏水核心區(qū)域，即剪切的活性位點(diǎn)，造成錯(cuò)誤剪切，引起胰島素依賴性PND[8]。這些研究證實(shí)，部分非半胱氨酸突變同樣可以導(dǎo)致MIDY。

本研究中上述3種基因突變其細(xì)胞培養(yǎng)液中胰島素原水平均與空質(zhì)粒相近，而低于野生型胰島素基因，提示任何原因所致的胰島素原錯(cuò)誤折疊都將阻斷其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至下游通路的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致胰島素合成減少。

3.4 導(dǎo)致成年發(fā)病的F(B25)L突變機(jī)制分析 本實(shí)驗(yàn)中F(B25)L突變細(xì)胞培養(yǎng)液中人胰島素原水平與野生型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示此類(lèi)型突變可能不影響胰島素原的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、加工和分泌，而主要通過(guò)影響胰島素與胰島素受體的結(jié)合，導(dǎo)致其生物活性的降低，引發(fā)糖尿病。

3.5 研究意義 雖然由胰島素基因突變所致的糖尿病在整個(gè)糖尿病人群中僅占很少的部分，但是由于不同胰島素原基因突變導(dǎo)致糖尿病的發(fā)病年齡、血糖水平及胰島素依賴程度不同，提示在PND、1B型糖尿病、部分MODY以及非肥胖2型糖尿病患者中篩查胰島素原突變基因，將有助于臨床治療策略的制定。對(duì)于不同突變胰島素原分子結(jié)構(gòu)和分泌通路的進(jìn)一步研究，將有助于更好地理解其他更常見(jiàn)原因，如胰島素抵抗型2型糖尿病等所引起的由胰島素原錯(cuò)誤折疊、ERS導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞功能衰竭的病理機(jī)制，為開(kāi)發(fā)可能糾正胰島素原錯(cuò)誤折疊、改善ERS的治療提供新策略和必要的理論基礎(chǔ)。

[1]萬(wàn)慧,賈偉平,張蓉,等.單基因突變糖尿病與2型糖尿病糖脂代謝指標(biāo)的比較[J].上海醫(yī)學(xué),2007,30(7):481-484.

[2]Liu M,Hodish I,Haataja L,et al.Proinsulin misfolding and diabetes:mutant INS gene-induced diabetes of youth[J].Trends Endocrinol Metab,2010,21(11):652-659.doi:10.1016/j.tem.2010.07.001.

[3]Greeley SA,Naylor RN,Philipson LH,et al.Neonatal diabetes: an expanding list of genes allows for improved diagnosis and treatent [J].Curr Diab Rep,2011,11(6):519-532.doi:10.1007/s11892-011-0234-7.

[4]Edghill EL,Flanagan SE,Patch AM,et al.Insulin mutation screening in 1,044 patients with diabetes:mutations in the INS gene are a common cause of neonatal diabetes but a rare cause of diabetes diagnosed in childhood or adulthood[J].Diabetes,2008,57(4):1034-1042.

[5]楊程,盧滇楠,張敏蓮,等.分子動(dòng)力學(xué)模擬二硫鍵對(duì)胰島素構(gòu)象穩(wěn)定性的影響[J].化工學(xué)報(bào),2010,61(4):929-934.

[6]Meur G,Simon A,Harun N,et al.Insulin gene mutations resulting in early-onset diabetes:marked differences in clinical presentation, metabolic status,and pathogenic effect through endoplasmic reticulum retention[J].Diabetes,2010,59(3):653-661.doi:10.2337/db09-1091.

[7]Liu M,Lara-Lemus R,Shan SO,et al.Impaired Cleavage of Preproinsulin Signal Peptide Linked to Autosomal-Dominant Diabetes[J].Diabetes,2012,61(4):828-837.doi:10.2337/db11-0878.

[8]Hussain S,Mohd Ali J,Jalaludin MY,et al.Permanent neonatal diabetes due to a novel insulin signal peptide mutation[J].Pediatric Diabetes,2013,14（4）:299-303.doi:10.1111/pedi.12011.

（2014-01-20收稿 2014-02-25修回）

（本文編輯 李鵬）

Study of Mechanism of Proinsulin Gene Mutations in Diabetes Mellitus

ZHANG Hongyan,CUI Jingqiu,LI Ning,LIU Ming,FENG Ping
Department of Metablism,Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China

ObjectiveTo construct several human proinsulin mutants plasmid related to diabetes and to express in INS-1(Insulin secreting beta cell derived line)cell.MethodsHuman mild proinsulin gene was used as template,and site-directed mutagenesis PCR was employed to generate four human proinsulin plasmid mutants.Each mutant plasmid was sequenced then transfected with empty plasmid and mild plasmid into INS-1 cell by liposome 2000.Insulin value in each cell solution was determined by radioimmunoassay.ResultsProinsulin mutants plasmid were confirmed by sequencing.Insulin values in culture solution of H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C mutants are less than those in wild type and H-F (B25)L（P＜0.05）.Comparison of insulin values between H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C groups were not statistically significant（P＞0.05）,and all these three groups showed no significant differences with empty plasmid group statistically（P＞0.05）.Insulin value of H-F(B25)L was of no significant differences statistically with empty plasmid（P＞0.05）.ConclusionFour human proinsulin mutants plasmid were constructed and expressed successfully in INS-1 cell,and different mutants plasmid result in diabetes through different mechanism.

mutagenesis,site-directed；plasmids；transfection；endoplastic reticulum stress；permanent neonatal diabetes mellitus；proinsulin misfolding；β cell failure

R587.1，R349.64

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.002

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：81070629）；天津市應(yīng)用及前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：11JCZDJC18500）

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院代謝病科（郵編300052）

△通訊作者 E-mail：cuijingqiu@sina.com