灃河水系脫氮微生物群落結(jié)構(gòu)研究

孫寓姣，趙 軒，王 蕾，盧思丹，丁愛中

北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院，北京 100875

灃河水系脫氮微生物群落結(jié)構(gòu)研究

孫寓姣，趙 軒，王 蕾，盧思丹，丁愛中*

北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院，北京 100875

河流水體氮素的超負(fù)荷不僅破壞了水體生態(tài)環(huán)境，也嚴(yán)重威脅著人類的生存和發(fā)展。水體中有機(jī)氮、無機(jī)氮（氨氮、亞硝氮、硝氮）和分子氮之間的轉(zhuǎn)化（氮循環(huán)）有賴于水體中大量的氮循環(huán)微生物（固氮細(xì)菌、硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌），然而這些氮循環(huán)微生物的生長繁殖也受到包括氮素的形態(tài)和濃度在內(nèi)的多種環(huán)境因子的影響，這些因素也通過影響氮循環(huán)微生物的生長繁殖進(jìn)而使得水體中氮素的轉(zhuǎn)化速率發(fā)生變化，對水體氮污染的防治有不可忽視的作用。本研究通過在灃河設(shè)置不同的研究斷面，采集水體樣品，進(jìn)行水質(zhì)分析，并通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)（PCR-DGGE）方法對研究斷面水體中氮循環(huán)微生物（固氮細(xì)菌、硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌）的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。再通過統(tǒng)計學(xué)軟件對所得分子生物學(xué)信息與水質(zhì)環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)灃河水體中氮循環(huán)微生物群落結(jié)構(gòu)受到多種環(huán)境因子共同影響，且在枯水期和豐水期表現(xiàn)出不同的特征。在豐水期灃河水體中，硝化細(xì)菌群落在中游表現(xiàn)出較高的多樣性和豐富性，這與灃河中上游農(nóng)業(yè)COD（化學(xué)需氧量）、BOD（生化需氧量）氨氮及有機(jī)氮污染物排放量較大，灃河水體DO（溶解氧）高有關(guān)。水體中的氨氮、亞硝氮、溫度的增加是促進(jìn)水體中硝化細(xì)菌的均勻性和豐富度的增高的主要因子，而pH值的升高，使得水體中硝化細(xì)菌的均勻性和豐富度降低。反硝化微生物在中游和下游的多樣性和豐富度較高，與有機(jī)物及硝酸鹽含量相關(guān)。水體中的BOD、COD、TP（總磷）、硝氮的增加是促進(jìn)水體中反硝化細(xì)菌的均勻性和豐富度的增高主要相關(guān)因子，而DO的增多則會對部分反硝化細(xì)菌產(chǎn)生不利影響，使得水體中反硝化細(xì)菌的均勻性和豐富度降低。本研究結(jié)果為灃河以及其他河流的污染控制以及基于微生物的生態(tài)修復(fù)提供了科學(xué)研究和工程實踐依據(jù)。

灃河；脫氮細(xì)菌；DGGE；環(huán)境因子

氮素是生物必須營養(yǎng)元素之一，也是維持水體生態(tài)平衡的重要物質(zhì)。然而近年來由于人類活動，如化肥的使用、生活垃圾的排放、化石燃料的燃燒等活動的日益加劇，陸地和水生態(tài)系統(tǒng)中氮污染物不斷增多。使得水環(huán)境中氮污染物含量增加，水體氮污染已成為目前人們最為關(guān)注的環(huán)境問題之一。我國七大水系整體輕度污染，氨氮（NH4+-N）為主要污染指標(biāo)之一；河流氮循環(huán)對與氮的遷移轉(zhuǎn)化和賦存形態(tài)及含量都有重要作用，是水體氮污染研究的重要方向之一。自然界中氮素存在3種形態(tài)：有機(jī)態(tài)氮、無機(jī)態(tài)氮（NH4+-N、NO3--N、NO2--N）和N2，各形態(tài)氮之間轉(zhuǎn)化的過程即為氮循環(huán)。河流水體中氮素天然來源極少，主要來源于點源、面源和內(nèi)源污染，河流中氮素的循環(huán)代謝主要是通過微生物作用實現(xiàn)。硝化細(xì)菌以氨氮為底物，氨氮濃度較低時難以滿足硝化細(xì)菌的需求，但濃度過高時又可能會抑制硝化細(xì)菌，所以水體氨氮濃度對硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。Lydmark等（2007）利用PCR-DGGE和FISH技術(shù)對中試污水處理系統(tǒng)中環(huán)境條件下硝化種群進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明氨氮是各種環(huán)境因素中最重要的因素，氨氮的濃度與硝化微生物細(xì)胞有著緊密的聯(lián)系。DO（溶解氧）是影響AOB（氨氧化細(xì)菌）群落結(jié)構(gòu)的重要因素，張丹等(2004)利用PCR-DGGE和FISH技術(shù)對生物脫氮系統(tǒng)中的AOB群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，AOB種群受DO的影響較大。硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與生物地球化學(xué)環(huán)境因素有關(guān)，硝酸鹽和氧是影響反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素(Liu等，2003)。Maribeb等（2005）對東南太平洋DO最低區(qū)域水體的nirS基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同采樣點反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)明顯不同，O2、NO2-、NO3-濃度和取樣樣深度等環(huán)境因素對水體反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有重要影響。Falk等（2006）對波羅的海沿岸水體反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，分析發(fā)現(xiàn)隨著生物地球化學(xué)因素的梯度變化，水體反硝化細(xì)菌的群落組成也有明顯變化。

氮循環(huán)微生物是影響河流水體氮遷移轉(zhuǎn)化的重要因素?，F(xiàn)有的研究多只針對水體氮素組成及含量，或氮轉(zhuǎn)化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，而由于河流水體微生物與環(huán)境因子相互影響，關(guān)系密切，對氮遷移轉(zhuǎn)化有重要影響，對河流氮循環(huán)進(jìn)行研究時必須將這些因素作為整體考慮。傳統(tǒng)微生物研究方法（顯微鏡觀察、微生物計數(shù)、分離純化等）都是以分離培養(yǎng)為基礎(chǔ)，利用微生物生理生化特性、遺傳及生態(tài)特性等進(jìn)行研究，且微生物鑒定主要是利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行選擇、純化、分離、根據(jù)形態(tài)、溫度、生物量、酶活性等指標(biāo)進(jìn)行種群鑒定。然而由于微生物外在的生長特征并不明顯，且其在自然界中的生長環(huán)境也比較復(fù)雜，實驗室中培養(yǎng)條件與其自然生長條件差異較大，難以真實模擬，所以實驗室中只能培養(yǎng)得到環(huán)境中極少部分（0.001%～15%）的微生物，且培養(yǎng)法所得結(jié)果及微生物情況也難以全面反應(yīng)樣品微生物信息的真實情況，不能對微生物進(jìn)行多樣性分析和統(tǒng)計（邢德峰等，2006）?；谂囵B(yǎng)的傳統(tǒng)微生物研究方法，只可作為輔助方法，必須與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，才能客觀、全面反映環(huán)境中的微生物信息。

灃河發(fā)源于秦嶺以北，主要靠雨水和冰雪融水補(bǔ)給。灃河上游水質(zhì)滿足地表水?-П類標(biāo)準(zhǔn)。入河點源、非點源污染物的排放及河流自凈能力等使得灃河水質(zhì)變化復(fù)雜，近20年來，灃河上游水質(zhì)污染總體略有加重，中下游水質(zhì)明顯改善, 但氮污染問題依然嚴(yán)峻。本研究通過在灃河（包括太平峪、高冠峪、潏河）設(shè)置24個研究斷面，采集水體樣品，進(jìn)行水質(zhì)分析，并通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)（PCR-DGGE）方法對研究斷面水體中氮循環(huán)微生物（固氮細(xì)菌、硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌）的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。通過統(tǒng)計學(xué)軟件對所得分子生物學(xué)信息進(jìn)行統(tǒng)計分析，并對環(huán)境因子與氮循環(huán)微生物信息之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。本研究結(jié)果為灃河以及其他河流的污染控制以及基于微生物的生態(tài)修復(fù)提供了科學(xué)研究和工程實踐依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 研究斷面的設(shè)置

樣品采集盡量考慮在河流每個分支設(shè)置采樣點，于豐水期在灃河干流和部分支流設(shè)置24個采樣斷面位置如圖1所示。

1.2 水樣采集

用有機(jī)玻璃采樣器采集水深0.5 m左右處水樣。用于基因組DNA提取的水樣，注入洗凈滅菌后的玻璃瓶中低溫帶回。其它水樣用預(yù)先洗凈的聚乙烯采樣瓶采集，低溫帶回實驗室檢測。

1.3 水質(zhì)監(jiān)測方法

在保存時限內(nèi)，送至西安市環(huán)境監(jiān)測站，對水樣進(jìn)行水質(zhì)理化指標(biāo)TN（總氮）、NH4+-N（氨氮）、NO3--N（硝氮）、NO2--N（亞硝氮）、COD（化學(xué)需氧量）、BOD（生化需氧量）、TP（總磷）等分析，其余如T（水溫）、pH、DO（溶解氧）、ORP（氧化還原電位）、SpC（電導(dǎo)率）等在調(diào)研采樣時用相關(guān)儀器現(xiàn)場監(jiān)測獲得。

圖1 采樣斷面位置Fig. 1 The sampling section positions

1.4 總DNA提取及脫氮基因PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增

水樣于24 h內(nèi)經(jīng)0.22 μm醋酸纖維素濾膜過濾，濃縮生物樣品。濾膜放置-20 °C保存。使用Omega Water DNA Kit（快速水質(zhì)DNA提取試劑盒）按其操作說明提取水體微生物的總DNA。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.4.1 硝化細(xì)菌的特異性擴(kuò)增

選擇氨氧化細(xì)菌16S rDNA的V3高變區(qū)的特異性引物CTO189F、GC-CTO189F和CTO654R進(jìn)行嵌套式PCR擴(kuò)增（OvreasL等，1998；Kowalchuk等,1997）。第一輪引物CTO189F（5’-GGA GRA AAG CAGGGGATC G-3’）和CTO654R（5’-CTA GCY TTG TAG TTT CAAACG C-3’）。以1μL DNA樣品為模板，PCR擴(kuò)增體系含有：2×Mix Maste（r不含染料）12.5 uL， 20 mmol上下游引物各1μL，無菌水補(bǔ)齊至25 μL。采用PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃/5 min；94 ℃/1min，55 ℃/1min，72℃/2min，30個循環(huán)，72 ℃/10min。使用無菌水替代DNA模板作為陰性對照。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒對產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。

第二輪引物GC-CTO189F（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG CACGGGGGGCC GGAGRA AAG CAGGGGATC G-3’）和CTO654R。目標(biāo)長度：約450 bp。以1 μL第一輪PCR產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增體系含有：2×Mix Master（不含染料）12.5 uL，20 mmol上下游引物各1 μL，無菌水補(bǔ)齊至25 μL。采用PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃/5 min；94 ℃/0.5min，55 ℃/0.5min，72 ℃/1min，30個循環(huán)，72 ℃/7min。使用無菌水替代DNA模板作為陰性對照。

1.4.2 反硝化微生物的nirS擴(kuò)增

通過對編碼細(xì)胞色素亞硝酸鹽還原酶（cd1-Nir）的nirS基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Throback等，2004；方芳等，2010；樊景鳳等，2011；宋亞娜等，2012）。引物：GC-nirS 3F（5’-GGC GGC GCG CCG CCC GCC CCG CCC CCG TCG CCC TTC CTB CAY GA CGG CGG C-3’）和nirS 6R（5’-CGT TGA ACT TRC CGG T-3’）。目標(biāo)長度約520 bp。以1μL DNA樣品為模板，PCR擴(kuò)增體系含有：2×Mix Master（不含染料）12.5 uL，20 mM上下游引物各1 μL，無菌水補(bǔ)齊至25 μL。采用PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃/10 min；94 ℃/1min，57 ℃/1min，72 ℃/2min，30個循環(huán)，72 ℃/10min。

PCR產(chǎn)物均用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后用北京博邁德生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒和PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收試劑盒對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。

1.4.3 基因擴(kuò)增片段變性梯度凝膠電泳（DGGE）

基因擴(kuò)增片段通過DGGE分離來研究微生物多樣性。聚丙烯酰胺的變性梯度范圍為35%～65%，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量約為200 ng，60 °C恒溫，120V恒壓條件下電泳8 h，電泳完畢后采用銀染技術(shù)染色，白光成像（Umax PowerLook 2100XL）。隨后使用Quantity One（凝膠成像分析系統(tǒng)）軟件對DGGE圖譜進(jìn)行分析，分析各泳道條帶數(shù)目及灰度。

氮循環(huán)微生物群落的多樣性分析利用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（SW）反映微生物群落結(jié)構(gòu)的均勻性（董志新等，2012），計算式為：

式中：Pi為泳道中第i個條帶灰度占其泳道所有條帶灰度之和的比例；

n為所在泳道條帶總數(shù)。

當(dāng)所研究的群落中只有一個物種時，SW最小，為0；當(dāng)所研究的群落中每個種都有一個成員時，SW最大，為SWmax。

基因的豐度（Species Number，SN）

SN=n

1.5 微生物群落結(jié)構(gòu)與水質(zhì)相關(guān)性分析

用Excel和Arc GIS對所得枯水期和豐水期灃河監(jiān)測斷面的水體中氮循環(huán)微生物多樣性指數(shù)和水質(zhì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析、繪制分布圖。通過統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20和生態(tài)統(tǒng)計學(xué)軟件CANOCO對微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相互關(guān)系進(jìn)行分析。

圖2 豐水期灃河水體氨氮分布情況Fig.2 Ammonia nitrogen distribution in wet season of Fenghe River

圖3 豐水期灃河水體硝氮分布情況Fig. 3 Nitrate nitrogen distribution in wet season of Fenghe River

2 結(jié)果與討論

2.1 豐水期灃河水質(zhì)特征

由于環(huán)境氣溫較高，灃河水體除源頭（10.9 ℃）外，其余監(jiān)測斷面水體溫度均在15 ℃以上，甚至在三里橋超過20 ℃。

除馬王村、五星蛟河大橋和王曲街道斷面DO小于7.5 mg·L-1（II類水）外，灃河水體DO整體較高，為富氧狀態(tài)。豐水期灃河水體氨氮分布情況如圖2所示。豐水期灃河水體硝氮分布情況如圖3所示。

從圖2可以看出，豐水期灃河水體氨氮含量均可達(dá)到國家地表水II類水標(biāo)準(zhǔn)，與豐水期水量大，對污染物有稀釋作用有關(guān)。且在所有研究斷面中，祥峪斷面河水氨氮質(zhì)量濃度最高（0.53 mg·L-1）。

從圖3可以分析出，灃河水體硝酸鹽氮濃度整體沒有明顯變化，除灃河源頭斷面水體硝氮濃度為0.77 mg·L-1外，均大于1.0 mg·L-1，且在祥峪、杜樊橋、小江村和太乙宮街道斷面水體硝氮濃度超過4.0 mg·L-1。

整體上看，灃河水體氮素污染主要集中于中下游，中游較為嚴(yán)重，與高榕等（2003）對灃河水質(zhì)變化特征的相關(guān)研究結(jié)果一致。兩次灃河調(diào)研也發(fā)現(xiàn)，灃河中游地區(qū)村莊密集，河岸邊垃圾堆放，甚至向河中傾倒垃圾的現(xiàn)象比較嚴(yán)重；下游地區(qū)由于城區(qū)較多，城區(qū)污水、垃圾處理設(shè)施較為完善，向河中亂丟垃圾廢棄物的現(xiàn)象也較少見，李英杰等（2011）也發(fā)現(xiàn)了此問題。可見，要改善灃河水質(zhì)問題，除了加強(qiáng)修復(fù)技術(shù)研發(fā)及應(yīng)用以外，更要提高當(dāng)?shù)厝罕姷沫h(huán)保意識。

2.2 脫氮菌多樣性指數(shù)變化

2.2.1 脫氮細(xì)菌SW多樣性指數(shù)變化

在豐水期，水體硝化細(xì)菌SW指數(shù)由圖4所示。硝化細(xì)菌基因16s特異區(qū)DGGE結(jié)果顯示出上游的灃河源頭、太平鄉(xiāng)斷面該指數(shù)相對較低，中游的王曲街道、北大村、五樓村、長安高橋、五星蛟河大橋、秦渡鎮(zhèn)以及下游的梁家橋和馬王村斷面水體中SW多樣性指數(shù)相對較高，在2.64～3.11之間。豐水期水體反硝化細(xì)菌nirS基因SW指數(shù)如圖5所示。反硝化細(xì)菌功能基因上游的灃河源頭、觀坪寺、李家?guī)r、太平鄉(xiāng)、小峪河橋斷面的nirS基因的SW多樣性指數(shù)相對較低，在2.11～2.58之間。中游的王曲街道、小江村、滈河橋、秦渡鎮(zhèn)和下游的馬王村斷面的水體nirS基因的SW多樣性指數(shù)相對較高，在3.03～3.29之間；而整體上看，豐水期灃河水體氮循環(huán)微生物香濃-威納多樣性指數(shù)SW相對枯水期較高。在硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌中，硝化細(xì)菌的SW多樣性指數(shù)相對較低。

豐水期硝化細(xì)菌多樣性指數(shù)（SW）從大到小的分布為：中游＞下游＞上游；反硝化細(xì)菌多樣性指數(shù)（SW）從大到小的分布為：中游＞下游＞上游。

2.2.2 脫氮細(xì)菌SN豐度指數(shù)變化

在豐水期，水體硝化細(xì)菌豐度SN如圖6所示。上游的灃河源頭、觀坪寺、灃峪口、太平鄉(xiāng)的硝化細(xì)菌的豐度相對較低，在4～9之間，而中游的北大村的硝化細(xì)菌的豐度均處于較高水平。下游的梁家橋的硝化細(xì)菌的豐度相對較高，在19～25之間。豐水期，水體反硝化nirS基因豐度SN如圖7所示。上游別的灃河源頭、觀坪寺、李家?guī)r、太平鄉(xiāng)nirS的豐度相對較低，在10～15之間。中游的王曲街道、小江村的nirS的豐度相對較高，在25～30之間；下游的馬王村的nirS的豐度均處于較高水平。整體上看，豐水期水期灃河水體氮循環(huán)微生物硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌中，硝化細(xì)菌的豐度SN相對較低。

硝化細(xì)菌多樣性指數(shù)（SW）和豐度（SN）從大到小的分布為：中游＞下游＞上游；而反硝化細(xì)菌在豐水期SW和SN指數(shù)從大到小的分布為：中游＞下游＞上游。

圖4 水體硝化細(xì)菌SW指數(shù)Fig. 4 SW index of nitrifying bacteria

圖5 豐水期水體反硝化細(xì)菌nirS基因SW指數(shù)Fig. 5 SW index of Denitrifying bacteria nirS gene in wet season

圖6 豐水期水體硝化細(xì)菌豐度SNFig. 6 Nitrifying bacteria abundance of SN in wet season

圖7 豐水期水體反硝化細(xì)菌nirS基因豐度SNFig. 7 Denitrifying bacteria nirS gene abundance SN in wet season

2.3 灃河氮循環(huán)微生物與水質(zhì)相關(guān)性分析

豐水期水體nirS基因豐度SN如圖8所示。圖8中，通過氮循環(huán)微生物群落多樣性指數(shù)、豐度和環(huán)境因子之間的夾角表示其間的相關(guān)性。夾角越小，表明其相關(guān)性越大，若箭頭同向，表示他們之間是正相關(guān)；若箭頭反向，則表示他們之間是負(fù)相關(guān)；若夾角接近于直角，則表示他們之間的相關(guān)性較小。因此可以判斷，若環(huán)境因子與氮循環(huán)微生物多樣性、豐度箭頭方向相同，則可以初步預(yù)測該氮循環(huán)微生物指數(shù)隨相應(yīng)環(huán)境因子指標(biāo)的增加而增加，因此由圖所示可以分析得到豐水期灃河氮循環(huán)微生物多樣性指數(shù)、豐度與環(huán)境因子之間關(guān)系。

2.3.1 硝化細(xì)菌多樣性指數(shù)、豐度與環(huán)境因子相關(guān)性分析

從圖8中可以看出，硝化細(xì)菌香濃-威納多樣性指數(shù)（SW-CTO-f）、豐度指數(shù)（SN-CTO-f）與氨氮正相關(guān)性最大，與亞硝氮、T、也顯示出了較大的正相關(guān)性。說明：

圖8 豐水期水體nirS基因豐度SNFig. 8 NirS gene abundance SN in wet season

水體中氨氮作為硝化細(xì)菌生長繁殖的底物，對硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)影響最大（Otawa等，2006；Lydmark等，2007），但是在豐水期灃河氨氮濃度變化范圍（＜0.530 mg·L-1）內(nèi)，氨氮的增加會提高硝化細(xì)菌的生存繁殖能力和多樣性，有利于硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；硝化細(xì)菌香濃-威納多樣性指數(shù)（SW-CTO-f）、豐度指數(shù)（SN-CTO-f）與亞硝氮正相關(guān)性，說明豐水期灃河中的硝化細(xì)菌可能會利用亞硝氮，亞硝氮的增加也有利于提高硝化細(xì)菌的多樣性和豐度；此外，硝化細(xì)菌香濃-威納多樣性指數(shù)（SW-CTO-f）、豐度指數(shù)（SN-CTO-f）還與pH呈現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)性。說明豐水期灃河水體中pH的升高,水體中陰離子含量增加會對水體中的氨氮的氧化產(chǎn)生一定的抑制作用。

2.3.2 反硝化nirS基因多樣性指數(shù)、豐度與環(huán)境因子相關(guān)性分析

從圖8中可以看出，反硝化nirS基因香濃-威納多樣性指數(shù)（SW-nirS-f）、豐度指數(shù)（SN-nirS-f）與BOD、COD、TP、硝氮呈現(xiàn)了一定的正相關(guān)性。說明BOD、COD作為碳源，對反硝化細(xì)菌的生長繁殖具有重要作用；硝氮是反硝化細(xì)菌作用的主要基質(zhì)，其含量變化是影響反硝化細(xì)菌群落的主要因素之一。此外，反硝化細(xì)菌香濃-威納多樣性指數(shù)（SW-nirS-f）、豐度指數(shù)（SN-nirS-f）還與DO呈現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)性。說明灃河水體中DO升高也會對反硝化細(xì)菌有抑制作用（Maribeb等，2005）。

3 結(jié)論

豐水期灃河水硝酸鹽氮濃度較高，污染較為嚴(yán)重，氨氮污染主要集中在中游。水體中脫氮微生物的多樣性指數(shù)、豐度受多種環(huán)境因子共同影響，群落在中游表現(xiàn)出較高的多樣性和豐富性。

水體中硝化細(xì)菌的均勻性和豐富度主要與水環(huán)境因子中氨氮、亞硝氮、T、成呈相關(guān)，主要與水體pH成負(fù)相關(guān)。

反硝化細(xì)菌多樣性指數(shù)、豐度主要與水環(huán)境因子中BOD、COD、TP、硝氮呈正相關(guān)，而主要與DO呈負(fù)相關(guān)。

FALK S, HANNIG M, BRAKER G, et al. 2006. NirS-containing denitrifier communities in the water column and sediment of the Baltic Sea[J]. Biogeosciences, 3: 697-727.

KOWALCHUK G A, BODELIER P, HEILIG G, et al. 1998. Community analysisofammonia- -oxidising baeteria, inrelation to oxygen availability in soils and root-oxygenated sediments, using PCR, DGGE and oligonucleotideProbehybridisation[J]. FEMS Microbiology Ecology, 27(4): 339-350.

LIU X D, SONIA M T, GINA H, et al. 2003. Molecular diversity of denitrifying genes in continental margin sediments within theoxygen-deficient zone off the pacific coast of Mexico[J]. Applied and Environmental Microbiology, 69(6): 3549-3560.

LYDMARK P, ALMSTRAND R, SAMUELSSON K, et al. 2007. Effects of environmental conditions on the nitrifying population dynamics in a pilot wastewater treatment plant[J]. Environmental Microbiology, 9(9): 2220-2233.

MARIBEB C G, GESCHE B, LAURA F, et al. 2005. Communities of nirS-type denitrifiers in the water column of the oxygen minimum zone in the eastern South Pacific[J]. Environmental Microbiology, 7(9): 1298-1306.

OTAWA K, ASANO R, OHBA Y, et al. 2006. Molecular analysis of ammonia-oxidizing bacteria community in intermittent aeration sequencing batch reactors used for animal wastewater treatment [J]. Environmental Microbiology, 8(11): 1985-1996.

OVREASL, FORNEYL, DAAEFL, et al. 1997. Distributionofbacterioplanktonin meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology, 63(9): 3367-3373.

THROB?CK IN, ENWALL K, JARVIS A, et al. 2004. Reassessing PCR primers targetingnirS ,nirK and nosZgenesfor community surveys of denitrifying bacteria with DGGE[J]. FEMS Microbiology Ecology, 49: 401-417.

ZHANG D, ZHANG D M, LIU Y P, et al. 2004. Community analysis of ammonia oxidizer in the oxygen-limited nitritation stage of OLAND system by DGGE of PCR amplified 16S rDNA fragments and FISH[J]. Journal of Environmental Sciences, 16(5): 838-842.

董志新, 孫波, 殷士學(xué), 等. 2012. 氣候條件和作物對黑土和潮土固氮微生物群落多樣性的影響[J]. 土壤學(xué)報, 49(1): 130-138.

樊景鳳, 陳佳瑩, 陳立廣, 等. 2011. 遼河口沉積物反硝化細(xì)菌數(shù)量及多樣性的研究[J]. 海洋學(xué)報, 33(3): 94-102.

方芳, 陳少華. 2010. 功能基因在反硝化菌群生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].生態(tài)學(xué)雜志, 29(9): 1836-1845.

高榕, 高兵, 洪暉. 2003. 西安市灃河流域重點污染物——有機(jī)污染物的特征分析[J]. 陜西環(huán)境, 10(6): 49-51.

李英杰, 程三友, 王莉, 等. 2011. 西安灃河1986-2009年水質(zhì)時空變化研究[J]. 中國農(nóng)村水利水電, 8: 1-5.

宋亞娜, 林智敏, 林艷. 2012. 氮肥對稻田土壤反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報, 20(1): 7-12.

邢德峰, 任南琪, 宋佳秀, 等. 2006. 不同16S rDNA靶序列對DGGE分析活性污泥群落的影響[J]. 環(huán)境科學(xué), 27(7): 1424-1428.

Study on the microorganisms of nitrogen cycle in Fenghe river

SUN Yujiao, ZHAO Xuan, WANG Lei, LU Sidan, DING Aizhong
College of Water Science,Beijing Normal University, Beijing 100875, China

Nitrogen (N) is among the paramount interests to biogeochemistry and life on earth. But pollution of N in river water will make a threat to the ecological environment and human life.The transformation among organic nitrogen, inorganic nitrogen (ammonia, nitrite, nitrate) and molecular nitrogen(N2) in river water, called nitrogen cycling, depends on the nitrogen cycle microorganisms (nitrogen-fixing bacteria, nitrifying bacteria and denitrifying bacteria). And these microorganisms and their activity of the nitrogen cycling are affected by a variety of environmental factors including the form and concentration of nitrogen, these factors affect the growth of microorganisms thus change the rate of transformation of nitrogen in water, which make a significant contribution to prevention of nitrogen pollution and removal of nitrogen pollutants. And thus a research of nitrogen cycle microbial and the related environmental factors is of great importance to removal of nitrogen pollutants in river water.Based on PCR-DGGE technology, water sampling points along the Feng River were set to study on the water quality and community of microorganisms related with nitrogen cycle. Then the related statistical softwares were used to analyze the relationship among the water quality and community of microorganisms related.In this study, during wet season, nitrifying bacteria community structure in the middle reaches is relatively rich in water, resulted from the agricultural COD, BOD, ammonia nitrogen, organic nitrogen emissions and high river water DO level. The increasing of BOD, ammonia nitrogen, nitrate nitrogen, T, TP promoted to the uniformity, richness of nitrifying bacteria in water, while the rising of pH reduced the uniformity and the abundance of nitrifying bacteria in water. Denitrifying bacteria community structure in the midstream and downstream is relatively rich in water, associated with organic matter and nitrate content. The increasing of BOD ,COD, TP, nitrate nitrogen was the main related factor of the uniformity, richness of denitrifying bacteria in water. While the rising of DO was harmful to part of denitrifying bacteria, and reduced the uniformity, richness of denitrifying bacteria. The results of this study provided the basis for pollution control and ecological restoration based on microbial technology in Fenghe River and other rivers.

Fenghe River; denitrification bacteria; DGGE; environment factors

X172

A

1674-5906（2014）09-1451-06

孫寓姣，趙軒，王蕾，盧思丹，丁愛中. 灃河水系脫氮微生物群落結(jié)構(gòu)研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2014, 23(9): 1451-1456.

SUN Yujiao, ZHAO Xuan, WANG Lei, LU Sidan, DING Aizhong. Study on the Microorganisms of Nitrogen Cycle in Fenghe River [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(9): 1451-1456.

國家自然科學(xué)基金項目（51178048，51378064）；北京師范大學(xué)自主基金項目（2014KJJCB22）

孫寓姣（1975年生），女，副教授，主要研究方向為環(huán)境生物技術(shù)，分子微生態(tài)學(xué)。E-mail:sunyujiao@bnu.edu.cn *通信作者：E-mail：sun201405@163.com

2014-09-11