拮抗玉米莖腐病菌的放線菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物理化性質(zhì)研究*

翟賀玲，王艷紅，高超，張波，何超

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶163319）

拮抗玉米莖腐病菌的放線菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物理化性質(zhì)研究*

翟賀玲，王艷紅*，高超，張波，何超

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶163319）

本文通過(guò)紙電泳、pH層析等方法研究了拮抗玉米莖腐病菌的放線菌發(fā)酵產(chǎn)物的理化性質(zhì)，同時(shí)也對(duì)其光穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，明確該放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物主要成分為水溶性的中性物質(zhì)，且具有較好穩(wěn)定性，這些理化性質(zhì)的研究為其下游工藝特別是產(chǎn)物分離提取方法的選擇提供理論依據(jù)。

玉米莖腐病菌；放線菌；發(fā)酵產(chǎn)物；理化性質(zhì)

玉米莖腐?。–orn stalk rot）是我國(guó)玉米生產(chǎn)上的一類重要病害，也是世界玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的一種土傳病害[1]，其發(fā)病率一般在15%～20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%以上[2]。因此，從生物防治角度考慮，廣譜高效的生防菌劑亟待開發(fā)。目前，放線菌是應(yīng)用最廣的生防微生物之一，其在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如醫(yī)藥領(lǐng)域、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[3]。菌株YH-1是黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)過(guò)程工程教研室從土壤中分離到的一株生防放線菌菌株，該菌株對(duì)玉米莖腐?。–orn stalk rot）有較強(qiáng)的拮抗作用。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行紙電泳、pH層析以研究其理化性質(zhì)，同時(shí)也對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行光穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，溶解度等進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以期為該菌株的進(jìn)一步研究，特別是下游工藝發(fā)酵產(chǎn)物分離提取方法的選擇提供參考，更期待為該菌株早日實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及所用試劑和實(shí)驗(yàn)器材

放線菌菌株YH-1，禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)過(guò)程工程教研室提供。

所用試劑均為分析純；所用主要實(shí)驗(yàn)器材：電泳儀、微量進(jìn)樣器、水平電泳槽、層析缸、無(wú)菌玻璃板等。

1.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.2.1 溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將放線菌菌株YH-1的發(fā)酵液放在50、4、-20℃放置20d，對(duì)照為室溫放置的發(fā)酵液，管碟法測(cè)定生物活性[4]。重復(fù)3次。

1.2.2 光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將放線菌菌株YH-1的發(fā)酵液在紫外光下分別照射2和4h，對(duì)照為未進(jìn)行紫外光照處理，管碟法測(cè)定生物活性[4]。重復(fù)3次。

1.3 紙電泳實(shí)驗(yàn)

采用新華1號(hào)中速濾紙順著紙紋方向裁成32cm×0.6cm的濾紙條，用微量進(jìn)樣器吸取放線菌

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將放線菌菌株YH-1的發(fā)酵液分別放在不同溫度：50、4、-20℃保存20d，管碟法測(cè)定抑菌活性，3次重復(fù)。

表1 溫度對(duì)YH-1發(fā)酵液活性的影響Tab.1 Effects of tempreture on fermentation activity of YH-1

從表1可以看出，冷凍效果最好，抑菌圈直徑的平均值27.2mm,其他溫度處理后抑菌圈直徑的平均值分別為26.1、26.7、27.2mm，與對(duì)照27.0mm相比，活性幾乎沒(méi)有降低，因此，放線菌菌株YH-1的發(fā)酵液具有很好的溫度穩(wěn)定性。菌株YH-1的發(fā)酵液10μL在濾紙中央點(diǎn)樣。在電泳槽的兩端貯液槽內(nèi)分別加pH值為4和pH值為8的Na2HPO-4檸檬酸緩沖液，用緩沖液均勻濕潤(rùn)濾紙條但點(diǎn)樣處勿浸入，標(biāo)記正負(fù)極，蓋好電泳槽蓋，并做好降溫處理。先在50V電壓下預(yù)電泳30min，再在150V的電壓下電泳1h，然后將電壓調(diào)到350V，繼續(xù)電泳2h后終止，取出晾干，生物顯影，對(duì)YH-1發(fā)酵產(chǎn)物性質(zhì)進(jìn)行判斷[5]。

1.4 極性和溶解度實(shí)驗(yàn)

極性和溶解度實(shí)驗(yàn)主要采用Betina[6]溶劑系統(tǒng)進(jìn)行，此溶劑系統(tǒng)包括：水；水飽和的苯；水飽和的正丁醇及水飽和的乙酸乙酯。

試驗(yàn)方法：取放線菌菌株YH-1的發(fā)酵液10μL點(diǎn)樣于新華一號(hào)濾紙上，上行展開，展開距離15cm，完畢后將紙條吹干，紫外線滅菌，生物顯影并測(cè)量Rf值[7]。

1.5 pH層析試驗(yàn)

對(duì)放線菌菌株YH-1的發(fā)酵液采用pH層析法[5]進(jìn)行酸堿性和離解度的測(cè)定。具體方法如下：

取新華一號(hào)中速濾紙，順著濾紙紙紋方向裁成長(zhǎng)17cm、寬0.6cm的9條濾紙帶，然后將各濾紙條用不同pH值的緩沖液處理，晾干，點(diǎn)樣10μL，在70%乙醇溶劑中上行展層，展開距離為15cm，完畢后將濾紙條吹干，紫外線滅菌，生物顯影并測(cè)量Rf值[7]。

2.2 光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將放線菌菌株YH-1的發(fā)酵液經(jīng)紫外線照射2和4h后，管碟法測(cè)定生物活性，結(jié)果見表2。

表2 光照對(duì)YH-1發(fā)酵液活性的影響Tab.2 Effects of different time on fermentation activity of YH-1

從表2可以看出，紫外光照射處理與同時(shí)段對(duì)照相比，活性幾乎沒(méi)有改變，存活率分別為98.5%和97.1%。這表明該菌的發(fā)酵液具有光照穩(wěn)定性的特點(diǎn)，可以進(jìn)一步應(yīng)用。

2.3 紙電泳實(shí)驗(yàn)

放線菌菌株YH-1的發(fā)酵液分別在酸性（pH4）和堿性（pH8）的緩沖液中進(jìn)行電泳，多次電泳結(jié)果表明，電泳時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物沒(méi)發(fā)生任何移動(dòng)，仍在在點(diǎn)樣點(diǎn)處（表3），說(shuō)明該發(fā)酵產(chǎn)物是中性物質(zhì)，此結(jié)果為下游工藝提供依據(jù)。

表3 YH-1發(fā)酵液的紙電泳結(jié)果Tab.3 Effects of paper electrophoresis of YH-1 fermentation

2.4 極性和溶解度實(shí)驗(yàn)

采用Betina溶劑系統(tǒng)進(jìn)行極性和溶解度實(shí)驗(yàn)，放線菌菌株YH-1發(fā)酵液在此溶劑系統(tǒng)中的Rf值見表4。

表4 YH-1發(fā)酵液在Betina溶劑系統(tǒng)中的Rf值Tab.4 Rfvalue of YH-1 fermentation in Betina solvents

從表4可以看出，該發(fā)酵液的活性成分在水中的R f值最大，在水飽和的苯和乙酸乙酯溶液中，活性組分沒(méi)有任何移動(dòng)，說(shuō)明該活性組分在水中的溶解度較好，在有機(jī)溶劑中溶解較少或者不溶解，因此，將活性組分鑒定為水溶性的抗生素。

2.5 pH層析試驗(yàn)

根據(jù)Betina溶劑系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，放線菌菌株YH-1的發(fā)酵液由于其發(fā)酵產(chǎn)物具有極性較強(qiáng)的特點(diǎn)，經(jīng)不同pH處理后，我們選擇70%乙醇溶劑展層，圖譜見圖1。

圖1 pH層析結(jié)果Fig.1 Results of pH chromatography

結(jié)果表明無(wú)論在在酸性區(qū)間還是在堿性區(qū)間Rf值基本在同一位置，基本沒(méi)有改變，與經(jīng)典抗生素圖譜相比，其pH層析圖譜為中性抗生素圖譜，因此推斷其活性組分為中性物質(zhì)，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與紙電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，均證明菌株YH-1的發(fā)酵液活性組分為中性物質(zhì)。

3 結(jié)論

放線菌菌株YH-1的發(fā)酵液經(jīng)對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定性較好，無(wú)論高溫處理還是低溫貯藏該發(fā)酵液仍保持很高的活性，對(duì)光不敏感，見光不易分解，因此，該發(fā)酵產(chǎn)物可開發(fā)成符合人們需要的、具有生防潛力的農(nóng)用抗生素，滿足人們對(duì)綠色產(chǎn)品的需求，在植物病害的田間防治上起到積極作用，具有較好的應(yīng)用價(jià)值和前景[8]。

對(duì)于放線菌菌株YH-1的發(fā)酵液的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，本研究主要進(jìn)行的紙電泳實(shí)驗(yàn)，生物顯影結(jié)果表明活性組分電泳時(shí)不向正負(fù)極移動(dòng)，只在點(diǎn)樣點(diǎn)處，可推斷其活性組分為中性抗生素；采用Betina溶劑系統(tǒng)進(jìn)行的紙層析試驗(yàn)明確了該放線菌發(fā)酵產(chǎn)物的有效組分極性較強(qiáng)，推測(cè)其屬于中性的水溶性抗生素，在有機(jī)溶劑中不溶解或者溶解較少；對(duì)其進(jìn)行的pH紙層析試驗(yàn)明確了YH-1發(fā)酵產(chǎn)物的有效組分在無(wú)論在酸性條件還是在堿性條件下其Rf值基本沒(méi)用變化，在約在同一條直線上，也就是說(shuō)Rf值不受pH值的影響，進(jìn)一步證明YH-1的發(fā)酵產(chǎn)物為中性物質(zhì)。因此，通過(guò)對(duì)放線菌菌株YH-1發(fā)酵液理化性質(zhì)的研究已明確其活性組分為中性物質(zhì)，此性質(zhì)又與劉秋等[9]的龜裂鏈霉菌菌株MY02發(fā)酵液中抑菌活性組份SN06相似，為下游工藝選擇分離方法提供理論依據(jù)，但二者的主要化學(xué)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、抗菌作用機(jī)制等方面是否相似還有待于進(jìn)一步研究。

［1］吳海燕,孫淑榮,范作偉,等.玉米莖腐病研究現(xiàn)狀與防治對(duì)策［J］.玉米科學(xué),2007,15（4）:129-132.

［2］陳潤(rùn)玲，檀尊社,趙保獻(xiàn),等.玉米莖腐病研究進(jìn)展［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005,14（6）:157-160.

［3］姜鈺,董懷玉,徐秀德,等.放線菌在植病生防中的研究進(jìn)展［J］.雜糧作物,2005,25（5）:329-331.

［4］田小衛(wèi).一株放線菌次生代謝產(chǎn)物抗菌活性的初步研究［J］.植物保護(hù),2004,30（2）：51-53.

［5］周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1997,339-345.

［6］丁立孝,王新,王東昌,等.農(nóng)用抗生素對(duì)煙草赤星病防治效果的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,21（2）：16-19.

［7］徐嬌,許文超,康占海,等.瓜果腐霉除草活性成分的分離鑒定［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42（6）:1994-2001.

［8］王燕,宗兆鋒,程聯(lián)社.放線菌在植物病害生物防治中的應(yīng)用［J］.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2005，4（3）:21-23.

［9］劉秋,吳元華,于基成.龜裂鏈霉菌菌株MY02發(fā)酵液中抑菌活性組份SN06的分離純化［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào),2004,31（4）:353-358.

Researching physico-chem ical properties of fermentation substance of the streptomycetes rivalrying corn stalk rot*

ZHAIHe-ling，WANG Yan-hong，GAO-Chao，ZHANG Bo，HE Chao
（Life Science and Technology College of Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Physico-chemical properties of fermentation substance of the streptomycetes rivalrying corn stalk rot were researched through paper electrophoresis and pH chromatography.At the same time,light stability and heat stability were also researched.The results showed that the fermentation substance was identified neutral and easily soluble in water.It had well stabilization.These properties had provided theory bases for downstream technology especially for separation and extraction methods.

corn stalk rot；actinomycete；fermentation substance；physico-chemical properties

Q935

A

1002-1124（2014）07-0007-03

2014-04-04

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”項(xiàng)目（xc2 013056）

翟賀玲（1990-），女，2010級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生。

王艷紅（1979-），女，講師，碩士，畢業(yè)于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，現(xiàn)主要從事微生物藥物相關(guān)的教學(xué)與科研工作。