嬰兒巨細(xì)胞病毒性肝炎外周血Treg及IL-l7表達(dá)水平與肝損傷的關(guān)聯(lián)性

孫曉紅，梁曉君，周會(huì)祥，冷耀明，王敏

(九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西九江332000)

嬰兒巨細(xì)胞病毒性肝炎外周血Treg及IL-l7表達(dá)水平與肝損傷的關(guān)聯(lián)性

孫曉紅，梁曉君，周會(huì)祥，冷耀明，王敏

(九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西九江332000)

目的探討嬰兒巨細(xì)胞病毒性肝炎(CMV)外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及白介素17(IL-17)表達(dá)水平與肝臟損傷的關(guān)聯(lián)性。方法43例CMV肝炎患兒根據(jù)其肝損傷程度分為輕癥組31例、重癥組12例，32例健康小兒作為正常對(duì)照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞百分比，ELISA法檢測(cè)血清IL-17的表達(dá)水平，熒光定量PCR(FQ-PCR)法檢測(cè)尿HCMVDNA載量，并同時(shí)測(cè)定血清膽紅素、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶水平，分析它們之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果43例CMV肝炎組外周血Treg細(xì)胞百分比顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.01)，其中重癥組外周血Treg細(xì)胞百分比也顯著低于輕癥組(P＜0.01)；而CMV肝炎組血清IL-17表達(dá)水平則顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，重癥組血清IL-17水平也顯著高于輕癥組(P＜0.01)；尿HCMV-DNA載量在CMV肝炎各組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。相關(guān)分析顯示，外周血Treg細(xì)胞百分比與IL-17呈負(fù)相關(guān)(r=-0.590，P＜0.01)，而血清IL-17水平與血清總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平呈正相關(guān)(r分別為：0.749，0.785，P＜0.01)。結(jié)論外周血Treg細(xì)胞及IL-17表達(dá)失衡可能在嬰兒巨細(xì)胞病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，且與肝損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

嬰兒；巨細(xì)胞病毒性肝炎；Treg；IL-17；TBIL；ALT

嬰兒巨細(xì)胞病毒性肝炎(infant cytomegalovirus hepatitis，ICH)是指在嬰兒時(shí)期由于先天或圍生期或生后感染人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，CMV)后引起的一類(lèi)感染性疾病，是由遺傳、機(jī)體免疫和環(huán)境因素共同作用所致，以黃疸、肝脾腫大、肝功能損害為主要臨床表現(xiàn)。巨細(xì)胞病毒可通過(guò)直接損害宿主細(xì)胞和免疫損傷引起肝細(xì)胞病變，CMV肝炎是其主要臨床發(fā)病類(lèi)型之一，常見(jiàn)于年幼和抵抗力弱的兒童，尤其是嬰兒期[1]，占嬰兒肝炎綜合征的50%。本文通過(guò)檢測(cè)CMV肝炎患兒外周血Treg細(xì)胞百分比、血清IL-17表達(dá)水平及尿人巨細(xì)胞病毒(HCMV-DNA)載量，探討其與肝損傷指標(biāo)血清血清膽紅素、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶水平的相關(guān)性，從而進(jìn)一步闡明Treg細(xì)胞、細(xì)胞因子IL-17介導(dǎo)的嬰兒巨細(xì)胞病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制，為該病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象選擇2010年2月至2013年4月我院門(mén)診和住院就診的CMV肝炎患兒36例，其中男20例，女16例，年齡1～3歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)采用1998年11月中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)感染消化學(xué)組制定的《巨細(xì)胞病毒感染診斷方案》[2]，經(jīng)PCR-DNA定量檢測(cè)確診為CMV病毒感染，均為初發(fā)未經(jīng)抗病毒及免疫抑制劑治療病例。根據(jù)臨床及B超排除膽道閉鎖排除膽道系統(tǒng)畸形、其他病毒性肝炎(如甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝、EB病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒感染所致的肝炎)及代謝和藥物性肝炎等。CMV肝炎組中31例血清總膽紅素＜170μmol/L、ALT＜200U/L者劃為輕癥組，12例血清總膽紅素≥170μmol/L和或ALT≥200U/L者劃為重癥組[3]。正常對(duì)照組選擇同期在本院健康體檢兒童32例，男18例，女14例，年齡1～3歲，經(jīng)檢測(cè)肝炎病毒抗體系列：HAV-IgM，乙肝表面抗原(HB-sAg)，丙肝抗體(IgG)，丁肝抗原(HDV-Ag)；戊肝抗體(IgM)，庚肝抗體(IgG)及PCR-CMVDNA均陰性，肝功能正常。隨機(jī)選取試驗(yàn)對(duì)象，使受試者在年齡、性別構(gòu)成上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。受試者家屬已知情同意本實(shí)驗(yàn)，且通過(guò)醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器和試劑本研究所用試劑：美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FITC-CD4抗體、APC-CD25抗體、PEFoxp3抗體；美國(guó)R&D公司生產(chǎn)的人IL-17檢測(cè)試劑盒；中山大學(xué)達(dá)安基因診斷公司生產(chǎn)的尿CMV-DNA試劑盒。所用儀器：FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，2010酶標(biāo)儀(丹麥Bio-Cell公司)，ABI 7500 FQ-PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 外周血Treg細(xì)胞百分率檢測(cè)全部對(duì)象均空腹采集EDTA抗凝血2ml,用淋巴細(xì)胞分離后,取白霧層洗滌離心，沉淀后PBS重懸，配成每個(gè)流式管內(nèi)1×106個(gè)細(xì)胞，再分別加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體(FITC-CD4、APC-CD25)，避光孵育30min。用透化液洗滌2次后PBS重懸。再加入抗人Foxp3+抗體，避光孵育30min。透化液洗滌細(xì)胞2次，按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程上機(jī)檢測(cè)，分析Treg細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。計(jì)算CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分率。

1.2.2 血清IL-17水平檢測(cè)清晨采用普通管抽取實(shí)驗(yàn)對(duì)象外周血2ml,3000r/min離心10min，吸取上清標(biāo)本分裝于EP管中,置-80OC冰箱凍存。采用雙抗體夾心法法測(cè)定血清IL-17水平，嚴(yán)格按試劑盒使用說(shuō)明操作。每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，酶測(cè)試儀450nm處讀數(shù)。

1.2.3 尿CMV-DNA檢測(cè)尿CMV-DNA檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。取中段清晨尿液2ml，800g離心10min，取沉淀物檢測(cè)DNA。使用廠家提供的配套軟件，并嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，每次檢測(cè)均帶室內(nèi)質(zhì)控，與樣本反應(yīng)管上機(jī)檢測(cè)。93℃2min預(yù)變性進(jìn)入循環(huán)，93℃30s55℃45s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，電腦計(jì)算尿CMV-DNA含量。陽(yáng)性：每毫升尿CMV-DNA載量大于103拷貝。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson分析法。以P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血Treg細(xì)胞的百分比、血清IL-17水平、尿CMV-DNA含量及血清TBIL、ALT水平CMV肝炎組外周血Treg細(xì)胞百分比顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.01)，重癥組外周血Treg細(xì)胞百分比也顯著低于輕癥組(P＜0.01)；而CMV肝炎組血清IL-17表達(dá)水平則顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01),重癥組血清IL-17水平也顯著高于輕癥組(P＜0.01)；CMV肝炎組血清TBIL、ALT水平顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)；尿HCMV-DNA載量在CMV肝炎各組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組外周血Foxp3+Treg、IL-17水平、尿CMV-DNA載量、血清TBIL、ALT水平的比較

2.2 相關(guān)性分析外周血Treg細(xì)胞百分比與IL-17呈負(fù)相關(guān)(r=-0.590，P＜0.01)，而血清IL-17水平與血清TBIL、ALT水平呈正相關(guān)(r分別為：0.749，0.785，P＜0.01)。

3 討論

巨細(xì)胞病毒具有典型的皰疹病毒形態(tài)。在自然人群中感染普遍多為隱性，對(duì)免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善的嬰兒表現(xiàn)為顯性感染，若不及早治療對(duì)嬰兒危害性很大。日本學(xué)者Yasumi等首先提出IL-17是一種肝臟嚴(yán)重性急性損傷的新標(biāo)志[4]。在肝細(xì)胞損害及病毒清除過(guò)程中，病毒、機(jī)體免疫狀態(tài)決定了嬰兒CMV的持續(xù)感染[5]。IL-17是一種前炎癥因子，被認(rèn)為是Thl7細(xì)胞產(chǎn)生的最主要的可以標(biāo)志其亞群的細(xì)胞因子，是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)早期啟動(dòng)因素，在多種肝病的發(fā)病及抗病毒免疫中均有表達(dá)[6]。具有較強(qiáng)的炎癥介導(dǎo)功能。而Thl7細(xì)胞與Treg細(xì)胞在分化過(guò)程及免疫效應(yīng)方面存在相互抑制、相互拮抗的效應(yīng)[7]。CMV最易侵犯管道上皮細(xì)胞，尤其是腎臟及肝膽系統(tǒng)[8]，上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞極易受CMV感染，肝臟作為病毒侵入嬰幼兒機(jī)體的重要靶器官，CMV感染嬰幼兒肝臟及膽管上皮細(xì)胞后，經(jīng)提呈抗原和白細(xì)胞粘附，催化產(chǎn)生多種細(xì)胞和基因參與免疫、炎癥的反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟感染進(jìn)一步加重[9]。Treg是機(jī)體負(fù)向調(diào)節(jié)外來(lái)抗原免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞亞群，是T淋巴細(xì)胞中表達(dá)CD4+CD25+Foxp3+的一類(lèi)T細(xì)胞亞型，通過(guò)細(xì)胞直接接觸以及分泌細(xì)胞因子IL-10和TGF-β等多種方式來(lái)抑制機(jī)體對(duì)外來(lái)物質(zhì)的有效性、保護(hù)性免疫應(yīng)答。Beriou等研究證實(shí)Treg細(xì)胞在高水平IL-1與IL-6的體系中可變?yōu)榉置贗L-17的Foxp3+IL-17細(xì)胞，同時(shí)失去抑制活性，說(shuō)明Treg細(xì)胞與Thl7細(xì)胞的可塑性可能參與了疾病過(guò)程[10]。CD4+CD25+Foxp3+是Treg細(xì)胞表型標(biāo)記。其最特異性的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3+，通過(guò)直接與Thl7細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ROR結(jié)合，抑制ROR介導(dǎo)IL-17A mRNA的轉(zhuǎn)錄，影響Thl7細(xì)胞的功能[11]，促進(jìn)Foxp3+對(duì)Treg細(xì)胞分化成熟和功能的發(fā)揮[12]。

為了解感染CMV致肝炎患兒炎癥因子分泌水平及T輔助細(xì)胞功能狀況，以及其與肝功能損害程度的相關(guān)性,筆者選擇Treg細(xì)胞、IL-17、TBIL、ALT水平作為檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果顯示CMV肝炎組Foxp3+Treg顯著低于對(duì)照組，IL-17水平顯著高于對(duì)照組，Treg細(xì)胞百分比及IL-17含量能夠反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫狀況，由此可判斷CMV患兒細(xì)胞免疫功能異常，細(xì)胞免疫狀態(tài)下降。因此，機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)的改變與CMV患兒的感染密切相關(guān)。在肝功能的各項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)中，ALT是反映肝細(xì)胞損害最敏感的指標(biāo)，TBIL反映肝臟合成與代謝狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，CMV感染患兒ALT、TBIL平均值比正常顯著高于正常對(duì)照組。提示作為患兒肝細(xì)胞損傷的診斷指標(biāo)，可早期發(fā)現(xiàn)癥狀性嬰幼兒CMV肝炎并積極治療。

采用熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行HCMVDNA定量檢測(cè)，其靈敏度高，已成為臨床檢測(cè)診斷CMV感染的重要手段，可提供病毒在患兒體內(nèi)存在的直接證據(jù)。尿HCMV-DNA水平及其水平的高低可以判斷患兒是否感染CMV以及鑒別診斷潛伏性CMV感染和活動(dòng)性CMV感染[13]。本研究通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)嬰兒尿液HCMV-DNA含量，發(fā)現(xiàn)CMV肝炎組尿液HCMV-DNA平均含量顯著高于正常對(duì)照組，因而在CMV肝炎患兒活動(dòng)性感染的早期診斷和療效監(jiān)測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，嬰兒巨細(xì)胞病毒性肝炎其HCMVDNA載量與HCMV疾病嚴(yán)重程度，病毒播散及細(xì)胞免疫功能紊亂有很大的相關(guān)性。提示在病情治療過(guò)程中，檢測(cè)患兒的免疫狀態(tài)以及病毒感染等實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，對(duì)患兒的病情監(jiān)測(cè)及后續(xù)治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Razonable RR.Cytolnegalovims infection after livertransplantation: current concepts and challenges[J].World J Gastroentero,2008,14 (31):4849-4850.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)感染消化組.巨細(xì)胞病毒感染診斷方案[J].中華兒科雜志,1999:37(7):441.

[3]于靜,陳奎生.巨細(xì)胞病毒肝炎患兒血清IL-6、IL-8水平檢測(cè)的意義[J].醫(yī)藥論壇雜志,2010,32(15):115-116.

[4]Yasumi Y,Talcikawa Y,Endo R,et a1.Interleukin-17 as a new marker of severity of acute hepatic injury[J].Hepatol Res,2007,37 (4):248-254.

[5]熊菀.更昔洛韋治療嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎的臨床療效及對(duì)細(xì)胞因子的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2010,26(11):1130-1132.

[6]劉嵐,傅睿.嬰兒巨細(xì)胞病毒性肝炎患兒肝組織中IL-17的表達(dá)[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué),2012,13(4):7-9.

[7]Yang XO,Nuriera R,Martinez GJ,et a1.Molecular antagonism andplasticity of regulatory and inflammatory T cell programs[J]. Immunity,2008,29(1):44-56.

[8]姚曄,萬(wàn)瓊,王衛(wèi)國(guó),等.應(yīng)用FQ-PCR和ELISA方法檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒感染的臨床價(jià)值[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(2):172-173.

[9]劉薇,蔣玉紅,王亞秋,等.血清總膽汁酸在嬰幼兒巨細(xì)胞病毒肝炎中的動(dòng)態(tài)變化及臨床意義[J].世界華人消化雜志,2006,14(25): 2563-2565.

[10]Beriou G,Costantino CM,Ashley CW,et a1.IL-17-producing human peripheral regulatory T cel1s retain suppressive function[J]. Blood,2009,l13(18):4240-4249.

[11]Ichiyama K,Yoshida H,Wakabayashi Y,et a1.Foxp3 inhibits RORgammat-mediated IL-17A mRNA transcription through direct interaction with RORgammat[J].J Biol Chem,2008,283(25):17003-17008.

[12]金華良,羅清莉,厲蓓,等.哮喘小鼠CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞和Foxp3蛋白的變化及淫羊藿苷干預(yù)作用[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2012,28(10):894-899.

[13]鄭曉群,馮晶晶,林虹,等.尿液上皮細(xì)胞中巨細(xì)胞病毒載量預(yù)測(cè)嬰兒巨細(xì)胞病毒激活感染的價(jià)值[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2009,32 (4):403-406.

R512.6，R446.62

A

1674-1129(2014)05-0528-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.05.013

2014-03-24；

2014-07-11)

孫曉紅，女，1971年出生，主管技師，學(xué)士學(xué)位，主要從事免疫學(xué)和微生物學(xué)檢驗(yàn)。

梁曉君，女，1985年出生，檢驗(yàn)師，學(xué)士學(xué)位，主要從事免疫學(xué)檢驗(yàn)和臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)。