2009年至2013年萍鄉(xiāng)市流感病例樣本real-time RT-PCR結(jié)果分析

鄧蘭，李晶鑫，鐘知情，張春芝，謝榮福，朱金華

(1、萍鄉(xiāng)市疾病預(yù)防控制中心，江西萍鄉(xiāng)337000；2、江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌330004)

2009年至2013年萍鄉(xiāng)市流感病例樣本real-time RT-PCR結(jié)果分析

鄧蘭1，李晶鑫1，鐘知情1，張春芝1，謝榮福1，朱金華2

(1、萍鄉(xiāng)市疾病預(yù)防控制中心，江西萍鄉(xiāng)337000；2、江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌330004)

目的通過對萍鄉(xiāng)市歷年流感樣病例的病毒核酸檢測結(jié)果分析，了解當(dāng)?shù)亓鞲幸咔闋顩r，分析當(dāng)?shù)亓鞲邪l(fā)病趨勢，為預(yù)防和控制流感流行提供科學(xué)論證憑據(jù)。方法萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院為國家流感樣病例監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院，對符合流感樣病例定義的病例收集相關(guān)信息，采集咽拭子標(biāo)本，采用實(shí)時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(real-time RT-PCR)對標(biāo)本進(jìn)行流感病毒核酸檢測，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果萍鄉(xiāng)市流感病毒核酸陽性率22.09%，其中2009年陽性率59.75%最高，之后呈下降趨勢。新甲型H1N1流感病毒和乙型流感病毒陽性數(shù)接近，構(gòu)成比分為33.74%和30.89%。新甲型H1N1共檢出陽性166例，其中2009年9-12月檢出陽性143例，2009年11月為最高峰，陽性率達(dá)到(75/143)52.45%，2010年以后有少量病例發(fā)現(xiàn)。乙型和季H3流感檢出陽性數(shù)逐年增加。男、女流感核酸陽性檢出率分別為23.19%(291/1255)和20.68%(201/972)。年齡分5個組統(tǒng)計分析，陽性率分別是37.25%、30.59%、19.40%、18.69%和13.00%。結(jié)論萍鄉(xiāng)市流感病例核酸陽性以新甲型H1N1和乙型為主；季H3流感病例核酸陽性有所增加，且新甲型H1N1在2009年12月后得到有效控制，流感病毒易感染人群以學(xué)齡兒童和青少年為主，性別無差異。

流感病毒；實(shí)時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法；病毒分型

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，俗稱流感。由于其經(jīng)呼吸道飛沫傳播，傳播迅速，加之其病毒抗原易發(fā)生變異，因而人群對變異株普遍易感，防控難度大，易發(fā)生暴發(fā)流行?；颊吲R床表現(xiàn)為發(fā)熱體溫≥38℃，并伴有咳嗽、流鼻涕、全身酸痛等體征[1]。萍鄉(xiāng)市于2009年9月建成流感病毒核酸檢測實(shí)驗室，并參與了國家流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗室流感應(yīng)急檢測，從2009年9月至2013年12月，本實(shí)驗室共采集了可疑流感病例的呼吸道咽拭子標(biāo)本2227份進(jìn)行流感病毒核酸檢測，現(xiàn)將檢測結(jié)果分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 資料來源和采集2009年9月至2013年12月，萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院接診的可疑流感病例，患者體溫≥38℃，伴咳嗽、流涕、全身酸痛等癥狀，且3d內(nèi)未服用任何抗病毒藥物。采集的樣品類型為鼻咽拭子，送檢途中冷藏。

1.1.2 儀器美國Promega Maxwell 16RAutomated Purification Instrument[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司]，ABI7300 real-time RT-PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司，型號：K30)；漩渦震蕩儀(德國IKA MS 3 basic)；高速離心機(jī)(型號：PICO 21)，生物安全柜(均為賽默飛世爾科技公司)。

1.1.3 試劑Promega Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purfication Kit[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司]；real-time RT-PCR試劑(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)：甲型流感病毒核酸檢測試劑盒(PCR熒光探針法，貨號：#DA-BN094)，乙型流感病毒核酸檢測試劑盒(PCR熒光探針法，貨號：#DA-BN095)，人流感病毒H3亞型核酸檢測試劑盒(PCR熒光探針法，貨號：#DA-BN144)，新甲型H1N1流感病毒(2009)RNA檢測試劑盒(PCR熒光探針法，貨號：#DA-BN093)等。

1.2 方法

1.2.1 生物安全所有實(shí)驗過程均在生物安全二級(BSL-2)安全實(shí)驗室中進(jìn)行。

1.2.2 實(shí)驗過程先將標(biāo)本經(jīng)充分振蕩混勻，嚴(yán)格按照所有試劑說明書要求進(jìn)行操作。

1.2.3 質(zhì)量控制嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，每次實(shí)驗均設(shè)立內(nèi)部質(zhì)控，陰性對照(NTC)和陽性對照(PTC)。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法SPSS13.0(for windows)軟件包分析統(tǒng)計，率的比較采樣χ2檢驗，以P＜0.0.5為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流感病毒核酸陽性分型及時間分布2009年9月至2013年12月共檢測疑似標(biāo)本2227例，檢出流感病毒核酸陽性492例，陽性率22.09%，其中以2009年陽性率59.75%為最高，逐年下降。流感病毒核酸分型檢測出新甲型H1N1、乙型和季節(jié)性H3陽性三種，無季節(jié)性H1，其中新甲型H1N1流感病毒陽性數(shù)166例，乙型流感病毒陽性數(shù)152例，兩者相接近，構(gòu)成比分別為33.74%和30.89%。新甲型H1N1共檢出陽性166(33.74%)例，其中2009年9月至12月檢出陽性143份，2009年11月為最高峰，陽性率達(dá)到(75/143)52.45%，2010年以后有少量病例發(fā)現(xiàn)。乙型和季H3流感檢出陽性數(shù)逐年增加，2012年和2013年流感病毒核酸陽性主要是以乙型和季H3為主。結(jié)果見表1和表2。

表1 流感病毒核酸檢測結(jié)果

表2 流感病毒核酸陽性分型統(tǒng)計表[n(%)]

2.2 流感病毒核酸陽性性別及年齡分布男、女分別檢測1255例和972例，檢出流感病毒核酸陽性分別為23.19%和20.68%，χ2=2.0，P＞0.05無顯著性差異，結(jié)果見表3。年齡分5個組統(tǒng)計分析，陽性率分別是37.25%、30.59%、19.40%、18.69%和13.00%。統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05，不同年齡核酸檢測陽性率有顯著差異，以學(xué)齡兒童和青少年為陽性率最高。結(jié)果見表3、表4。

表3 不同性別人群流感病毒核酸檢測陽性統(tǒng)計表

表4 不同年齡流感病毒核酸陽性分型統(tǒng)計表[n(%)]

3 討論

real-time RT-PCR是國內(nèi)外新建立的一套快速準(zhǔn)確的診斷技術(shù)，其原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，在逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增后，通過對熒光進(jìn)行測定來對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，該方法具有特異性強(qiáng)、自動化程度高等特點(diǎn)，可有效解決PCR污染問題[2]，并且操作簡單，靈敏度高。從核酸的提取到病毒的檢測，全程僅需3～4h，大大縮短了病毒的檢測周期，為流感的防控提供了及時可靠的實(shí)驗室依據(jù)，還能針對不同亞型檢測，它對流感暴發(fā)的防治和監(jiān)測具有非常重要的作用。本實(shí)驗室現(xiàn)階段使用real-time RT-PCR法檢測流感病毒，其結(jié)果為最終的確診結(jié)果[3]。

萍鄉(xiāng)市近五年的流感病毒核酸檢測結(jié)果顯示，萍鄉(xiāng)市流感病毒優(yōu)勢株為新甲型H1N1流感毒株和乙型流感毒株。在2009年9月至12月，檢出的流感毒株主要為新甲型H1N1流感毒株，陽性數(shù)為143份(75.26%)，2009年11月為陽性檢出數(shù)高峰期，陽性率達(dá)到(75/143)52.45%；2010年以后有少量病例發(fā)現(xiàn)，其流行趨勢與我國南方部分地區(qū)相似[4]，且新甲型H1N1在2009年12月后得到有效控制。乙型流感病毒和季節(jié)性H3流感病毒檢出陽性數(shù)呈逐年增加，2012年和2013年流感病毒核酸陽性主要是以乙型流感和季節(jié)性H3流感為主。萍鄉(xiāng)市近五年的流感核酸檢測結(jié)果分析還顯示流感病毒核酸陽性病例與性別無差異，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報道的我國其他地區(qū)一致[5]。流感病毒核酸陽性年齡分布以15～24歲組最高(37.25%)，其次為5～14歲組(30.59%)，新甲型H1N1陽性也是以15～24歲組最高(19.43%)最高。提示萍鄉(xiāng)市流感病毒的易感人群是學(xué)齡兒童和青少年，在今后流感的防控應(yīng)重點(diǎn)放在學(xué)齡兒童和青少年中，加強(qiáng)對該人群的健康教育，提高其自我防護(hù)意識，并做好流感疫苗為主導(dǎo)的綜合性預(yù)防措施[6]。

[1]董曉毅,孫長貴.H7N9禽流感病毒感染及其實(shí)驗室診斷[J].實(shí)驗與檢驗醫(yī)學(xué),2013,31(2):105-107.

[2]穆晞惠.熒光定量PCR技術(shù)及其在生物檢測中的應(yīng)用[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2006,27(23):1227-1229.

[3]穆煜,于俊峰,常曉,等.快速甲型/乙型流感抗原篩查試驗與H1N1 PCR檢測結(jié)果的比較與評價[J].實(shí)驗與檢驗醫(yī)學(xué),2010，28(2): 105-106.

[4]羅燕,周愛華,黎冠,等.邵陽市2009年流感流行病毒核酸檢測結(jié)果分析[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,17(12):2512-2513.

[5]高潔,韓亦菲,李妹霖,等.2009-2011年漢中地區(qū)甲型流感檢測分析[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2012,27(2):125-127.

[6]周珺,鄒明霞,熊英,等.2007年江西省甲3亞型流感毒株HA1基因特性的分析[J].實(shí)驗與檢驗醫(yī)學(xué),2008,26(6):613-614.

Analysis of real-time RT-PCR detection for influenza samples from 2009 to 2013 in Pingxiang city

DENG Lan,LI Jingxin, ZHONG Zhiqing,et al.Center for Disease Control and Prevention of Pingxiang City,Jiangxi Pingxiang 33700,China.

Objective To analyze the data from surveillance of influenza virus in Pingxiang city over the years and to explore the epidemic situation of influenza and incidence trend of influenza so as to provide scientific evidence for prevention and control of influenza credentials.Methods The relevant informations and throat swab specimens were collected from influenza-like patients at the Pingxiang City People's Hospital，which is a national influenza surveillance hospital.The influenza virus nucleic acid was detected by using real-time RT-PCR method and statistical analysis was performed.Results In Pingxiang city,the positive rate of nucleic acid of influenza virus was 22.09%,but in 2009 the positive rate was 59.75%，which was the highest and then declining year by year.The positive rates of new influenza A(H1N1)virus and influenza B virus were close,which were 33.74%and 30.89%respectively.166 samples were positive for new influenza A(H1N1),of which 143 samples were positive from September to December in 2009,the highest peak in November 2009,the positive rate was(75/143)52.45%,a small number of cases was detected after 2010.The positive rate of B influenza and H3 influenza were increasing year by year.The positive rate in male were 23.19%(291/1255)and 20.68%(201/972)in female respectively.Conducting statistical analysis according to the age of five groups,the positive rate was 37.25%,30.59%,19.40%,18.69%and 13.00%,respectively.Conclusions In Pingxiang influenza virus was mainly new influenza A(H1N1)and B influenza.The H3 influenza was increasing,but the new influenza A(H1N1)was effectively controlled after December 2009.The population susceptible to influenza virus was mainly school children and teenagers, there was no gender differences.

Key words：Influenza virus；Real-time reverse-transcription polymerase chain reaction；Virus genotyping

R373.1+3

A

1674-1129(2014)05-0511-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.05.007

2014-07-24；

2014-08-10)

鄧蘭，女，1977年6月生，本科，主管技師，主要從事與疾病預(yù)防工作有關(guān)的檢驗工作。

朱金華，男，1977年1月生，碩士，高級實(shí)驗師，主要從事中醫(yī)藥與病原生物學(xué)研究工作。