埃博拉病毒感染及其實(shí)驗(yàn)室檢查

林迪，孫長(zhǎng)貴

(解放軍第117醫(yī)院檢驗(yàn)科南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)控中心，浙江杭州310013)

·述評(píng)·

埃博拉病毒感染及其實(shí)驗(yàn)室檢查

林迪，孫長(zhǎng)貴

(解放軍第117醫(yī)院檢驗(yàn)科南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)控中心，浙江杭州310013)

據(jù)世界衛(wèi)生組織官方報(bào)道，截至2014年8月4日埃博拉病毒累計(jì)感染1 711人，并致932人死亡。埃博拉病毒是一種能引起人類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物產(chǎn)生埃博拉出血熱的烈性傳染病病毒，該病毒致死率極高，為50%～90%。本文就該病毒的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性、流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、診斷與鑒別診斷和實(shí)驗(yàn)室檢查等作簡(jiǎn)要綜述。

埃博拉病毒；出血熱；流行病學(xué)；感染

埃博拉病毒(Ebola virus)感染人類(lèi)和非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(NHPs)會(huì)引起病毒性出血熱、以發(fā)熱為特征的急性系統(tǒng)性疾病、凝血障礙、暴發(fā)性休克和死亡[1]。2014西非埃博拉病毒疫情于2014年2月首次爆發(fā)于幾內(nèi)亞境內(nèi)，隨后迅速蔓延，這次疫情中死亡人數(shù)已經(jīng)超過(guò)了過(guò)去37年的總和，并有失控情況。由于埃博拉病毒的自然宿主至今尚未確定，針對(duì)埃博拉病毒感染尚無(wú)疫苗、藥物可以預(yù)防或治療，雖然一些研究的療法可以減輕埃博拉病毒感染的影響，但目前還沒(méi)有FDA批準(zhǔn)的用于暴露后人類(lèi)使用的治療方法[2]。所以疫情控制都集中于對(duì)病毒感染者進(jìn)行維持療法，將他們隔離以限制疫情蔓延。本文就埃博拉病毒相關(guān)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制、流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、診斷與鑒別診斷和實(shí)驗(yàn)室檢查等作簡(jiǎn)要綜述。

1 埃博拉病毒的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)屬絲狀病毒科，為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，一般呈長(zhǎng)絲狀體，有時(shí)也可能出現(xiàn)“U”字、“6”字形、纏繞、環(huán)狀或分枝型，其長(zhǎng)度約為19 kb，含有7個(gè)基因，依次編碼核蛋白(NP)、病毒蛋白35(VP35)、病毒蛋白40(VP40)、糖蛋白(GP)、病毒蛋白30(VP30)、病毒蛋白24(VP24)和RNA聚合酶(L)[3]。NP主要為核衣殼蛋白質(zhì)；VP30和VP35功能尚不明確，但通過(guò)與MBV比較表明，它可能參與基因復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)節(jié)；VP40是一種基質(zhì)蛋白，參與膜成分和NP的相互作用[4]；GP是通過(guò)轉(zhuǎn)錄編輯鏈接的兩個(gè)開(kāi)放讀碼框ORF1和ORF2編碼，與毒力蛋白結(jié)構(gòu)密切相關(guān)；VP24是一種小的膜蛋白，與毒力蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)；L蛋白是一種RNA依賴(lài)的RNA聚合酶。目前，根據(jù)發(fā)源地和抗原特性可將埃博拉病毒分為五個(gè)亞型：扎伊爾型(ZEBOV)、蘇丹型(SEBOV)、萊斯頓型(REBOV)、科特迪瓦型(CEBOV)和本迪布焦型(BEBOV)，除萊斯頓型對(duì)人不致病外，其余四種亞型感染后均可導(dǎo)致人發(fā)病。其中ZEBOV和SEBOV對(duì)人具有致命性。

埃博拉病毒在常溫下較穩(wěn)定，對(duì)熱有中等度抵抗力，56℃不能完全滅活，60℃1h方能破壞其感染性；紫外線(xiàn)照射2min可使之完全滅活；對(duì)化學(xué)藥品敏感，乙醚、去氧膽酸鈉、β-丙內(nèi)酯、福爾馬林、次氯酸鈉等消毒劑可以完全滅活病毒感染性；鈷60照射、γ射線(xiàn)也可使之滅活。EBOV在血液樣本或病尸中可存活數(shù)周；4℃條件下存放5周其感染性保持不變，8周滴度降至一半。-70℃條件可長(zhǎng)期保存。

2 發(fā)病機(jī)制

一些相關(guān)研究認(rèn)為埃博拉病毒感染以炎癥介質(zhì)的上調(diào)為主要特點(diǎn)，如細(xì)胞因子、趨化因子、干擾素誘導(dǎo)蛋白和腫瘤壞死因子α(TNF-α，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，引發(fā)炎癥，阻止病毒復(fù)制，被認(rèn)為和埃博拉病毒型出血熱的高致死率有非常高的聯(lián)系)[5-10]；此外，跨膜糖蛋白在埃博拉病毒感染中扮演者重要角色，主要發(fā)病機(jī)理見(jiàn)圖1[11]。

3 流行病學(xué)

1976年埃博拉病毒首次爆發(fā)于蘇丹南部和扎伊爾(即現(xiàn)在的剛果埃博拉河地區(qū))，到目前為止埃博拉病毒呈現(xiàn)明顯的地方間歇性流行，局限在非洲扎伊爾、蘇丹、烏干達(dá)、加蓬、南非等地區(qū)[12-14]，非洲以外地區(qū)偶有病例報(bào)道，但均屬于輸入性或?qū)嶒?yàn)室意外感染。該病毒季節(jié)性分布不十分明顯，也尚無(wú)資料表明不同性別間存在發(fā)病差異。2014年新爆發(fā)于幾內(nèi)亞的西非埃博拉病毒疫情，經(jīng)德國(guó)漢堡Bernhard Nocht熱帶醫(yī)學(xué)研究所的Stephan Gunther博士等人通過(guò)完整基因組測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，來(lái)自幾內(nèi)亞的埃博拉病毒為新型埃博拉病毒株，它形成一個(gè)獨(dú)立的分支，與目前已知的來(lái)自剛果民主共和國(guó)和加蓬的埃博拉病毒株并列，由同一祖先平行演變而來(lái)[15]。該病毒早期確診病例的病死率為86%，臨床疑似病例的病死率為71%，這與先前的EBOV爆發(fā)的病死率一致[16-18]。

圖1 埃博拉病毒感染主要發(fā)病機(jī)理示意圖

據(jù)世界衛(wèi)生組織官方報(bào)道，截至2014年8月4日埃博拉病毒累計(jì)感染1711人，并致932人死亡。其中幾內(nèi)亞感染495例(351例確診病例,133例可能病例，11例疑似病例)，死亡363人；利比里亞感染516例(143例確診病例,252例可能病例，121例疑似病例)死亡282人；尼日利亞感染9例(0例確診病例，2例可能病例,7例疑似病例),死亡1例；塞拉利昂感染691例(576例確診病例，49例可能病例，66例疑似病例)死亡286人。

3.1 傳染源和宿主動(dòng)物感染埃博拉病毒的人和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物為本病傳染源。雖然到目前病毒還尚未分離到，但狐蝠科的果蝠很有可能是埃博拉病毒的天然宿主，尤其是錘頭果蝠、無(wú)尾肩章果蝠和小領(lǐng)果蝠[19]。

3.2 傳播途徑直接接觸感染者和被感染動(dòng)物的血液、分泌物、排泄物或其他體液，病毒也可經(jīng)黏膜和破損的皮膚進(jìn)行傳播；醫(yī)務(wù)人員在治療、護(hù)理病人或處理病人尸體過(guò)程中如沒(méi)穿戴合適的個(gè)人防護(hù)設(shè)備，也可能會(huì)接觸到病毒。

3.3 高危人群醫(yī)務(wù)人員、與病人有密切接觸的家庭成員或其他人、在葬禮過(guò)程中直接接觸死者尸體的人員和在雨林地區(qū)接觸了森林中死亡動(dòng)物的人等。

4 臨床表現(xiàn)和病理特點(diǎn)

本病潛伏期為2～21d，典型病例為急性起病，高熱、畏寒、頭痛、肌痛、惡心、結(jié)膜充血及相對(duì)緩脈。隨后可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、黏液便或血便、皮疹等表現(xiàn)。重癥患者可出現(xiàn)神志改變，如嗜睡、譫妄等癥狀。并可出現(xiàn)不同程度的出血表現(xiàn)，包括鼻、口腔、結(jié)膜、胃腸道、陰道、皮膚出血或咯血、血尿等，可出現(xiàn)低血壓、休克等?？刹l(fā)心肌炎、肺炎和其它多臟器受損。

主要病理改變是皮膚、黏膜、臟器的出血，多器官可以見(jiàn)到灶性壞死。肝細(xì)胞點(diǎn)、灶樣壞死是本病的典型特點(diǎn)，可見(jiàn)小包含體和凋亡小體。

5 診斷與鑒別診斷[20,21]

5.1 診斷根據(jù)流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，可做出埃博拉病毒感染的診斷。

5.1.1 流行病學(xué)史來(lái)自于疫區(qū)，或3周內(nèi)有疫區(qū)旅行史，或有與病人、感染動(dòng)物接觸史。

5.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

5.1.2.1 疑似病例具有上述流行病學(xué)史和臨床表現(xiàn)。

5.1.2.2 可能病例指經(jīng)臨床醫(yī)生評(píng)估的任何疑似病例或無(wú)法收集標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)，并擁有與確診病例相關(guān)的流行病學(xué)特征的任何已故疑似病例。

5.1.2.3 確診病例疑似病例基礎(chǔ)上具備實(shí)驗(yàn)室檢查任一項(xiàng)檢查陽(yáng)性者。實(shí)驗(yàn)室檢查陽(yáng)性者包括：病毒抗原陽(yáng)性、血清特異性IgM抗體陽(yáng)性、恢復(fù)期血清特異性IgG抗體滴度比急性期有4倍以上增高、患者標(biāo)本中檢出埃博拉病毒RNA及患者標(biāo)本中分離到埃博拉病毒。

5.2 鑒別診斷應(yīng)與馬爾堡出血熱、克里米亞剛果出血熱、拉沙熱和腎綜合征出血熱等病毒性出血熱，傷寒、惡性瘧疾、病毒性肝炎、鉤端螺旋體病和斑疹傷寒等疾病鑒別。鑒別診斷主要依靠病原學(xué)檢查。

6 實(shí)驗(yàn)室檢查

6.1 一般檢查可見(jiàn)白細(xì)胞和血小板減少、凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)和轉(zhuǎn)氨酶升高(AST＞ALT)，有時(shí)可見(jiàn)血清淀粉酶升高，早期可有蛋白尿。

6.2 病原學(xué)及相關(guān)檢查

6.2.1 電鏡檢查電鏡直接觀(guān)察標(biāo)本培養(yǎng)物上清液中的病毒粒子，根據(jù)病毒粒子的大小、形狀及粒子內(nèi)的核衣殼鑒定是否為埃博拉病毒。

6.2.2 病毒抗原檢測(cè)由于埃博拉出血熱有高滴度病毒血癥，可采用ELISA等方法檢測(cè)血標(biāo)本中病毒抗原。一般發(fā)病后2～3周內(nèi)，可在患者血標(biāo)本中檢測(cè)到病毒特異性抗原。

6.2.3 病毒核酸檢測(cè)對(duì)于埃博拉病毒檢測(cè)目前主要通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測(cè)病毒RNA。一般發(fā)病后2周內(nèi)可從病人血標(biāo)本中檢測(cè)到病毒核酸，發(fā)病后1周內(nèi)的標(biāo)本檢出率高。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道使用Real-time PCR檢測(cè)埃博拉病毒，該方法檢測(cè)蘇丹型和扎伊爾型埃博拉病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)均大于0.99，靈敏度可達(dá)1.0×101拷貝/μl，Realtime PCR檢測(cè)的敏感度較普通PCR提高106～l07倍，7種其他對(duì)照烈性病病原體檢測(cè)均呈陰性[3]，其快速、靈敏、特異以及較好的重復(fù)性為埃博拉病毒的快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。Real-time PCR檢測(cè)蘇丹型和扎伊爾型埃博拉病毒引物和探針序列見(jiàn)表1[3]。Real-time PCR反應(yīng)體系為25μl，包括：2×預(yù)混合液(Premix Ex TaqTM，含有酶、dNTP和Mg2+等成分)12.5μl，ZEBOV或SEBOV上、下游引物各0.5μl (10nmol/L)，探針0.5μl(10nmol/L)，模板1.0μl，用滅菌蒸餾水補(bǔ)足到25μl，混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃，預(yù)變性60s；95℃，變性5s；60℃，退火/延伸30s，45個(gè)循環(huán)。見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物和探針序列

6.2.4 病毒分離采集急性發(fā)熱期患者血標(biāo)本，用Vero、Hela等細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，一般發(fā)病1周內(nèi)血標(biāo)本病毒分離率高。

6.2.5 血清學(xué)檢測(cè)據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，最早可從發(fā)病后2d的患者血清中檢出特異性IgM抗體，IgM抗體可維持?jǐn)?shù)月。發(fā)病后7～10d可檢出IgG抗體，IgG抗體可維持?jǐn)?shù)年。多數(shù)患者抗體出現(xiàn)于起病后10～14d，也有重癥病人始終未能檢出抗體。間隔1周及以上的兩份血標(biāo)本IgM抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或IgG抗體滴度4倍及以上升高具有診斷意義。血清特異性IgM抗體多采用IgM捕捉ELISA法檢測(cè)[22,23]；血清特異性IgG抗體多采用ELISA、免疫熒光等方法檢測(cè)。

7 結(jié)束語(yǔ)

因?yàn)榘２├《镜母咧滤缆?，加上目前尚未有任何疫苗被證實(shí)有效，WHO將埃博拉病毒列為生物安全四級(jí)病原菌，并被視為潛在的生物戰(zhàn)劑之一。對(duì)于埃博拉病毒美國(guó)傳染病專(zhuān)家海曼也做出這樣的描述:埃博拉病毒是人類(lèi)迄今為止未能征服的致命殺手，是世界醫(yī)學(xué)界面對(duì)的一道難以解讀的“哥德巴赫猜想”。因此，只有深入研究埃博拉病毒的感染機(jī)制，才能有利于埃博拉病毒疫苗和藥物的研發(fā)。目前，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院免疫學(xué)家安東尼-弗契帶領(lǐng)的研究小組最新研制出一種可以預(yù)防埃博拉病毒感染的疫苗，并實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)猴子完全有效，預(yù)計(jì)將于今年9月份對(duì)人類(lèi)進(jìn)行臨床測(cè)試。成功研發(fā)疫苗并臨床應(yīng)用是預(yù)防和控制埃博拉病毒感染與傳播的有效手段。

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R373.9

A

1674-1129(2014)05-0495-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.05.001

2014-08-12；

2014-08-28)

林迪，女，生于1987年10月，本科，技師，從事臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)。

孫長(zhǎng)貴，男，生于1962年9月，碩士研究生導(dǎo)師，主任技師，教授。