扶正解毒方對(duì)前胃癌荷瘤小鼠術(shù)后復(fù)發(fā)模型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的干預(yù)研究?

賈程輝，李枋霏，何莉莎，李 杰△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科,北京 100053； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

近年來，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages，TAM)并非發(fā)揮抗腫瘤作用，而是參與并促進(jìn)腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程[1～3]。目前認(rèn)為，巨噬細(xì)胞至少包括2種不同的活化表型和功能特征亞群[4]：①經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophages，caMphi) M1型；②替代性活化的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages，aaMphi) M2型。Mantovani等[5]認(rèn)為，M1型和M2型巨噬細(xì)胞是巨噬細(xì)胞連續(xù)活化狀態(tài)的兩個(gè)極端，并指出TAM可能發(fā)生替代性活化，更偏向于M2型極化的巨噬細(xì)胞，遞呈抗原的能力很弱，能抑制T細(xì)胞增殖，參與腫瘤的生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，以及適應(yīng)性免疫、血管生成和間質(zhì)形成等過程[6]。CD分子是確定淋巴細(xì)胞表型和分離純化淋巴細(xì)胞的重要依據(jù)。已有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，M2型巨噬細(xì)胞表面甘露糖受體(CD206)表達(dá)明顯上調(diào)，而M1型巨噬細(xì)胞FcγⅢ/Ⅱ受體CD16/32表達(dá)增加，兩者是判斷巨噬細(xì)胞類型的重要表面標(biāo)志，其中誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化的因子包括IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β1。本實(shí)驗(yàn)在原有實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察扶正解毒中藥抑制腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并推測可能通過抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞因子的表達(dá)，改善腫瘤微環(huán)境，促使M2型巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)近交系6～7周615小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥品鑒定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 瘤株 小鼠前胃癌細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理室用甲基卞基亞硝胺灌胃誘發(fā)而成,移植率100%。

1.1.3 藥物 實(shí)驗(yàn)用扶正解毒方為深棕色浸膏，每1 g浸膏含生藥6 g，由黃芪、黨參、生白術(shù)、枸杞子、土茯苓、制何首烏、藤梨根組成制劑由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院制劑室提供。陽性對(duì)照化療藥物為5-氟脲嘧啶注射液10 ml/支、0.25 g/支,由上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 試劑 Mouse IL-4、 IL-10 、IL-13 、TGF-β Immunoassay ELISA Kit (R&D,USA)；PE anti-mouse F4/80 ，PE Rat IgG2a,κ Isottype Ctrl (Biolegend,USA)；APC anti-mouse CD206 ，APC Rat IgG2a, κ Isottype Ctrl (Biolegend,USA)；FITC anti-mouse F4/80，F(xiàn)ITC Rat IgG2a, κ Isottype Ctrl (Biolegend,USA)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模 復(fù)蘇小鼠前胃癌細(xì)胞(MFC)，傳代培養(yǎng)3代，對(duì)數(shù)生長期時(shí)胰酶消化終止生長，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×107/ml，取0.05 ml瘤細(xì)胞懸液接種于小鼠左側(cè)后肢爪墊內(nèi)側(cè)皮下(移植時(shí)避免細(xì)胞懸液外溢)。

1.2.2 給藥方法 足墊接種MFC細(xì)胞后14 d切除原發(fā)瘤，依據(jù)原發(fā)瘤重隨機(jī)分組。對(duì)照組為不接瘤的正常小鼠及不接瘤但實(shí)行截肢手術(shù)小鼠，其他組為接瘤組。①對(duì)照組(Normal-operation、Normal)：自截肢后24 h給予小鼠飲水灌胃，每日0.2 ml，每日1次；中藥組(FZJD-treated)：自截肢后24 h給予小鼠扶正解毒中藥灌胃，每日0.2 ml，每日1次。每公斤體質(zhì)量小鼠用藥量相當(dāng)于成人(按60 kg計(jì))臨床用量的15倍；化療組(5-FU- treated)：從截肢后當(dāng)日給予5-氟脲嘧啶注射液，按照20 mg/kg 劑量腹腔注射 0.2 ml，每天1次，連續(xù) 7 d；②中西醫(yī)結(jié)合組(FZJD+5-FU)：自截肢后24 h給予小鼠扶正解毒中藥灌胃，每日1次0.2 ml。每公斤體質(zhì)量小鼠用藥量相當(dāng)于成人(按60 kg計(jì))臨床用量的15倍。并給予5-氟脲嘧啶注射液，按照20 mg/kg 劑量腹腔注射 0.2 ml，每天1次，連續(xù)7 d；模型組(untreated)：自截肢后24 h給予小鼠飲水灌胃，每日1次0.2 ml。15 d后處死小鼠，取血、復(fù)發(fā)瘤和脾臟組織。

1.3 檢測

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測M1、M2型巨噬細(xì)胞表型 將復(fù)發(fā)瘤、脾臟從小鼠身上剝離，PBS沖洗干凈，稱取組織1 g分別置于培養(yǎng)皿中(預(yù)冷)，用無菌眼科剪剪成小塊置濾膜中研磨。吸取所有研磨液濾至新離心管中，1200 rpm離心5 min，倒走上層清液；2%FBS-PBS1200 rpm離心洗滌3次，每次5 min；將細(xì)胞重懸在2%FBS-PBS，即為腫瘤組織的單細(xì)胞懸液，0.4%臺(tái)酚藍(lán)染色，顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，顯示細(xì)胞存活率大于90%；取1×106個(gè)細(xì)胞重懸于100 μl 2%FBS-PBS中，用微量移液槍滴加PE-F4/80+和APC-CD206+、FITC-CD16/32抗體各2 μl，避光孵育20 min；PBS洗滌2遍，將細(xì)胞重懸于300 μl 1%多聚甲醛中過濾，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.2 ELISA法檢測IL-4、IL-10、IL-13 、TGF-β1的含量 制取小鼠血清分裝樣本儲(chǔ)存于-80℃冰箱中，檢測前置于室溫融化。每個(gè)微孔中加入50 μl Assay Dilute RD液，再分別加入50 μl標(biāo)準(zhǔn)檢測樣本、對(duì)照樣本、小鼠血清樣本，輕輕拍打微板框1 min充分混勻，蓋上黏條室溫孵育2 h。吸走微孔中的液體，加入400 μl的wash buffer洗滌5次，將微孔板翻轉(zhuǎn)在厚紙巾上拍打直至吸干所有液體。在每個(gè)微孔中加入100 μl抗體結(jié)合物Conjugate，蓋上黏條，室溫孵育2 h；重復(fù)洗滌步驟，在每個(gè)微孔中加入100 μl顯色反應(yīng)液Substrate Solution，室溫避光孵育30 min，在每個(gè)微孔中加入100 μl反應(yīng)終止液Stop solution，輕輕拍打微板以混勻，將微板置于酶標(biāo)儀，在450 nm與570 nm波長下檢測吸光度OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 扶正解毒中藥對(duì)脾臟組織中M2、M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)含量的影響(表1)

2.2 扶正解毒中藥對(duì)腫瘤組織中M2、M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)含量的影響(表2)

2.3 扶正解毒中藥對(duì)不同組織不同干預(yù)模式下M2/M1比值的影響(表3)

2.4 前胃癌小鼠血清中腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá) (表4)

3 討論

國家“八五”期間，我科采用扶正解毒方劑配合化療治療胃腸癌術(shù)后277例。臨床研究表明，該藥不但能增加化療完成率，Ⅲ期胃癌5年生存率比健脾益腎沖劑同期胃癌5 年生存率還提高了9.1% ，生存期得到一定延長[8]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扶正解毒方聯(lián)合5-FU抑制局部腫瘤復(fù)發(fā)率達(dá)75%，抑制遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移率達(dá)50.07%，抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率達(dá)75.80%，提高生存期率達(dá)16.91%，與臨床研究結(jié)果相符，且同單一治療方案比較具有明顯優(yōu)勢(shì)。

表1 脾臟組織中M2、M1型巨噬細(xì)胞含量

注：中西醫(yī)結(jié)合組與模型組、化療組、中藥組比較：#P<0.05；與正?？瞻捉M、空白術(shù)后組比較：P>0.05； 模型組與其他各組比較：*P<0.05

表2 腫瘤組織中M2、M1型巨噬細(xì)胞含量比較

注：中西醫(yī)結(jié)合組與模型組比較：#P=0.036<0.05；與中藥組、化療組比較：P>0.1；模型組與其他各組比較：*P=0.034<0.05

表3 不同組間M2/M1比值情況變化表

注：模型組與其他各組比較：*P=0.000<0.05)； 中西醫(yī)結(jié)合組與中藥組、化療組比較：#P<0.05； 模型組與其他各組比較**P=0.000<0.05；中西醫(yī)結(jié)合組與中藥組、化療組比較：&P<0.05

表4 小鼠血清中腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)表

注：中西醫(yī)結(jié)合組與模型組比較：#P=0.013<0.05； 模型組與其他各組比較：*P<0.05；模型組與其他各組比較：**P<0.05；中西醫(yī)結(jié)合組與模型組、中藥組、化療組比較：&P<0.05

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages，TAM)是腫瘤間質(zhì)的主要組成部分，約占腫瘤間質(zhì)中炎癥細(xì)胞的30%～50%。Porta等[9]在總結(jié)前人TAM研究成果的基礎(chǔ)上，提出巨噬細(xì)胞具有殺傷腫瘤和促瘤生長的雙重作用。M1型巨噬細(xì)胞可通過直接或間接分泌多種促炎性細(xì)胞因子殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞；而M2型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為較低的抗原提呈能力，并可通過分泌抑制性細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β等下調(diào)免疫應(yīng)答。IL-4 、IL-10、IL-13 和 TGF-β都是與 M2 型巨噬細(xì)胞有著密切關(guān)系的細(xì)胞因子。腫瘤組織可釋放這些細(xì)胞因子使血液中的單核細(xì)胞募集并分化為 TAM，而 TAM 本身也可分泌這些因子從而促進(jìn)腫瘤的生長。如此形成一個(gè)惡性循環(huán)，使得 TAM 浸潤程度加深，腫瘤惡性進(jìn)程加快。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測，M2型巨噬細(xì)胞和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性且關(guān)系密切。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，接瘤組和非接瘤組M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)含量明顯高于非接瘤組；不同組織中，表達(dá)含量差異明顯，脾臟中M1型含量大于M2型，而腫瘤組織中與之相反；不同的干預(yù)模式下，模型組(只接瘤不藥物干預(yù))M2型巨噬細(xì)胞的含量明顯高于其他組，M1型巨噬細(xì)胞含量低于其他組，給予扶正解毒中藥、5-FU、中西結(jié)合治療后M2、M1變化明顯。

M2/M1比值對(duì)于胃癌的預(yù)后評(píng)估有一定的參考意義， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，脾臟組織中兩者比值呈“斜坡形”下降，腫瘤組織中者的比值呈“峭壁形”下降。無論是腫瘤組織、脾臟組織中M2/M1，模型組均高出其他組若干倍，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。給予扶正解毒中藥、化療藥、中西結(jié)合治療后，數(shù)值下降趨勢(shì)非常明顯。相較于單一細(xì)胞值來講，二者比值更為靈敏，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β1助長了腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M高表達(dá)M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子，腫瘤可引起4種因子的高表達(dá)；單純使用扶正解毒中藥干預(yù)后，4種因子含量有所降低，IL-3、TGF-β1的含量甚至比化療組更低，中西結(jié)合組下降更明顯；不同組別細(xì)胞因子的表達(dá)趨勢(shì)同腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)一致，從側(cè)面證明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞同腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。

總之，扶正解毒方在一定程度上促使M2型巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，抑制M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，從而抑制腫瘤生長和血管、淋巴管生成，一定程度上降低了腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移力，而中西藥的聯(lián)合能有效抑制腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

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