通心絡(luò)對糖尿病大鼠心肌成纖維細胞PCNA的影響?

張常喜，楊愛萍，謝春毅

(1.寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，銀川 750021； 2.上海市中西結(jié)合醫(yī)院，上海 200082)

通心絡(luò)膠囊具有益氣活血、通絡(luò)止痛、清熱解毒之功效，臨床上對于多種心血管疾病均有一定的治療效果。糖尿病心肌病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，而心肌纖維化是導致糖尿病心肌病變的一個主要因素[3]。大量實驗證明，通心絡(luò)對血脂、內(nèi)皮素ET-1有很好的調(diào)整作用，且能抑制心肌組織的纖維化[1～3]。通心絡(luò)還能明顯改善糖尿病(DM)大鼠心功能和心肌病理情況，減少心肌膠原容積分數(shù)，降低心肌MMP-9、TIMP-1與TGF-B1 蛋白的表達及含量，進而起到預(yù)防糖尿病心肌病的作用[4]。本實驗擬通過觀察通心絡(luò)對糖尿病心肌病變大鼠血糖、PCNA的影響，探討通心絡(luò)對糖尿病心肌纖維化防治的作用靶點。

1 材料

1.1 動物

清潔級SD雄性大鼠60只，平均體質(zhì)量(210±20)g，由上海復(fù)旦大學動物實驗中心提供(許可證號SCXK滬2002-0002)。動物飼養(yǎng)溫度25℃，濕度40%。

1.2 藥品、試劑與儀器

通心絡(luò)膠囊由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供，增殖細胞核抗原(PCNA)購自美國Santa Cruz公司，天狼猩紅、鏈脲佐菌素為Sigma公司產(chǎn)品，苦味酸購自上海鈺森生物技術(shù)有限公司，血糖試紙購自德國羅氏公司。

萬能研究用顯微鏡(日本Olympus公司型號BX51型)，圖像分析系統(tǒng)(德國ZEISS公司，Axioskop2 plus)，圖像分析軟件(IMAGE-PRO PLUS (VER 4.1))，德國羅氏公司的G1ucolxend血糖儀。

2 方法

2.1 動物分組

雄性SD大鼠60只，隨機取17只作為對照組，正常飼養(yǎng)，不給予特殊處理。其余43只SD大鼠禁食12 h后，按55 mg/kg體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射濃度為1 mg/ml的鏈脲佐菌素(STZ)，注射72 h后大鼠尾尖采血，羅氏血糖儀測定空腹血糖。血糖值>16.7 mmol/L，伴有多飲、多食和多尿者確定為糖尿病(DM) 模型大鼠。其中7只血糖升高但不合格者，按30 mg/kg體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素，72 h后再測最終造模成功。40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組和通心絡(luò)治療組2組，每組再各分8周和12周2個時間段組，每組10只。對照組、模型組每天給予2 ml生理鹽水灌胃，通心絡(luò)治療組給予通心絡(luò)膠囊中的藥粉按1.0 g/kg-1·d-1濃度稀釋于2 ml生理鹽水中灌胃。實驗共持續(xù)12周，每4周監(jiān)測血糖1次。實驗過程中因造模失敗與灌胃不當剔除7只大鼠，最終53只大鼠納入統(tǒng)計。除對照組大鼠外，糖尿病組及各藥物組大鼠均出現(xiàn)多食、多飲、多尿、消瘦、體質(zhì)量減輕等癥狀，在實驗周期內(nèi)大鼠未發(fā)現(xiàn)酮癥酸中毒表現(xiàn)者。

2.2 取材

分別于8周和12周2個實驗點，給予實驗動物腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉處理，腹主動脈采血約10 ml分離血清備用，處死大鼠并取出心臟剔除心房，留取心室肌組織，稱重后10%甲醛固定，24 h后逐級脫水、石蠟包埋、5 μm厚切片，進行病理、免疫組化檢測。

2.3 檢測項目及方法

2.3.1 免疫組化染色測心肌PCNA% 免疫組化染色測心肌組織中PCNA的表達，用鼠抗體PCNA結(jié)合抗原后行免疫組化染色，陽性指數(shù)測PCNA%。心肌細胞核內(nèi)棕黃色顆粒為PCNA的抗原抗體復(fù)合物；切片于光鏡下200倍放大，采用圖像分析軟件對染色陽性物質(zhì)進行測定，計算PCNA 陽性細胞百分比(陽性細胞數(shù)占視野中所有細胞總數(shù)的百分比)，每張片子隨機選擇6個視野，取其均數(shù)。

2.3.2 心肌膠原檢測 對制備好的心肌組織采用天狼猩紅染色，組織中紅色為陽性膠原，采用圖像分析軟件對染色陽性物質(zhì)進行測定：測定灰度均值和陽性面積百分比(紅色膠原占視野中組織的百分比)，每張片子隨機選擇6個視野取其均數(shù)。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組糖尿病大鼠血糖變化

表1 各組糖尿病大鼠血糖值比較(mmol/L)

注：與對照組比較:##P<0.01

表1顯示，實驗過程中模型組與通心絡(luò)治療組大鼠血糖水平均明顯高于對照組(P<0.01)，通心絡(luò)8周治療組血糖水平略低于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，通心絡(luò)治療組血糖水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)

3.2 各組心肌組織免疫組化染色后PCNA的變化

表2圖1顯示，模型8周、12周組心肌PCNA%較正常大鼠增加，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；模型組心肌PCNA%，12周組較8周組明顯增加 (P<0.01)；通心絡(luò)治療組心肌PCNA%較模型組明顯減少(P<0.01)，通心絡(luò)治療12周組PCNA%較8周組有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組心肌組織免疫組化染色后PCNA百分比(%)

注：與對照組比較:#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較:△△P<0.01;與8周組比較：＊＊P<0.01

3.3 各組大鼠心肌膠原表達比較

表3 各組大鼠心肌膠原表達百分比(%)

注：與對照組比較：#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較:△P<0.05

表3顯示，實驗8周、12周時，模型組大鼠心肌膠原表達明顯高于對照組(P<0.01)。通心絡(luò)8周、12周治療組大鼠心肌膠原表達分別明顯低于模型8周、12周組(P<0.05)。

4 討論

PCNA是DNA聚合酶δ的附屬蛋白，與細胞增殖有關(guān)，參與DNA合成，分子量36 KD，是僅能在增

圖1 PCNA免疫組化染色(×200)

殖細胞中合成和表達的核內(nèi)多肽鏈。PCNA是DNA合成不可缺少的物質(zhì)，而DNA合成是細胞增殖周期中的關(guān)鍵，PCNA的合成與表達和細胞增殖周期相關(guān)，于G1晚期出現(xiàn)，S期達高峰，G2期下降，M期及G0期無表達。因此，PCNA的合成及表達與細胞的增殖狀態(tài)、分化活躍程度有關(guān)，是一個敏感的檢測指標，被廣泛用于細胞增殖功能的檢測[5]。

目前PCNA已被應(yīng)用于研究心肌細胞和心肌成纖維細胞的增殖活性[6]。本實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病對心肌的主要影響為促進心肌膠原的沉積，導致心肌的纖維化。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌的纖維化除發(fā)生心肌成纖維細胞的增殖外，亦存在心肌細胞的增殖，但心肌細胞增殖的比例非常低[7]。成纖維細胞是心肌細胞外基質(zhì)的主要來源，其功能和心肌重塑、心肌纖維化有密切關(guān)系[8]，心肌成纖維細胞的增殖是心肌纖維化的主要因素，PCNA的表達可以較準確地反映心肌成纖維細胞的增殖狀態(tài)[9]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病對心肌的主要影響為促進膠原的增生沉積，從而導致心肌的纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病8周組、12周組PCNA的表達明顯高于對照組，且12周組高于8周組，說明隨著糖尿病的進展成纖維細胞的增生越來越明顯，其增生促進了膠原的增生沉積。陳東明等[10]也通過實驗證明，成纖維細胞促進心肌膠原表達。本實驗發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)對糖尿病大鼠的血糖無明顯降低作用，但能明顯抑制糖尿病大鼠心肌膠原[3],同時能明顯抑制心肌PCNA的表達，說明通心絡(luò)是在成纖維細胞增殖水平上抑制了糖尿病心肌的纖維化。本研究初步說明，通心絡(luò)對糖尿病心肌纖維化病變有良好的預(yù)防作用。

[1] 忻尚平, 程志清.通心絡(luò)對病毒性心肌炎慢性期心肌纖維化作用的實驗研究[J].中醫(yī)藥學刊，2006, 24(2): 301-302.

[2] 譚安雄, 李小云, 王玉銀，等.通心絡(luò)對自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2009,20(7):1767-1769.

[3] 張常喜，楊愛麗，謝春毅.通心絡(luò)對糖尿病心肌膠原代謝的作用[J].中西結(jié)合心腦血管病雜志，2009,12:235-237.

[4] 趙田田，王曉梅.中藥通心絡(luò)對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響[J].中國老年學雜志，2011, 31(1):95-98

[5] Zheng H，Shao C L，Qian J Q．Efects of DDPH on expression of PCNA，TGFIM，collagen 111 in cardiac hypertrophy caused by partial narrowing abdominal aorta in rat[J].Chin Pharmacol Bull，2000,16(3):296-298．

[6] FUJISAWA H，KOIDE N，KONOT，et al．Expression of basic fibroblast growth factor and its receptor-1 in cardiac myxoma[J]．J Cardiovase Surg(Torino)，2002,43(5):589-594．

[7] Matturri L，Milei J，Grana D R，Lavezzi A M．Characterization of myocardial hypertrophy by DNA content， PCNA expression and apoptotic index[J].Card，2002，82(1):33-39．

[8] 盛瑞，顧振綸，謝梅林.EGCG抑制心肌肥厚膠原生成和細胞增殖[J].中國藥理學通報，2006， 22(9):1095-1099.

[9] 朱中生，王晉明，陳紹良.自發(fā)性高血壓大鼠心肌增殖細胞核抗原(PCNA)的表達以及厄貝沙坦和咪噠普利的影響[J].高血壓雜志，2003， 11(3):266-270.

[10] 陳東明，鮑衛(wèi)漢，徐少駿，等.低血清培養(yǎng)對瘢痕成纖維細胞PCNA、p16、Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的影響[J].北京大學學報(醫(yī)學版)，2001, 33(6):580-581.