內異康復片對EM大鼠血清及異位內膜細胞中ARO、COX-2、E2水平的影響?

徐曉娟，秦旭華，王婧婧，王 張,黃立華，鐘艷梅

(1.成都中醫(yī)藥大學， 成都 611137；2.成都市第七人民醫(yī)院， 成都 610075)

子宮內膜異位癥(endometriosis，EM)是育齡婦女中的常見病和多發(fā)病，該病屬于中醫(yī)學“癥瘕”等范疇，近年來有明顯上升趨勢，已成為嚴重影響中青年婦女健康和生活質量的婦科難治性疾病之一。內異康復片是成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院多年來臨床治療EM的特色院內制劑，處方源于臨床驗方，療效確切。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)[1～3]，對子宮內膜異位癥模型大鼠、小鼠可降低血液黏度，促進血液流動，有改善微循環(huán)、抑制異位內膜血管的生成、促進異位內膜萎縮等作用。為深入探討其作用機理，我們采用體內體外實驗研究方法對內異康復片治療EM機制進行了進一步的探討。

1 材料

1.1 藥物

內異康復片由大血藤、半枝蓮、熟大黃、桃仁、水蛭等10余味中藥組成，每片0.3 g，100片/瓶(批準文號川藥制字Z20070659)，成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院生產(批號20120403)。療程3個月，成人日用量每日3次，每次服用4～6片。來曲唑片，每片2.5 mg，12片/盒，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(批號2012-03-20)。

體外實驗時，首先用乳缽將內異康復片搗碎，采用密閉容器，于4 ℃冰箱內以DMEM培養(yǎng)液浸泡內異康復片72 h(比例為0.1 g/ml，其中超聲振蕩助溶2 h)，取上清液，0.22 μm微孔濾器過濾后，得到內異康復片浸提液，實驗時用DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度使用；來曲唑片用DMEM培養(yǎng)液溶解，0.22 μm微孔濾器過濾后使用。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司(批號NXE0631)；無支原體胎牛血清，浙江天杭生物科學有限公司(批號111020)；美國R&D公司(進口分裝)，Rat-Estradiol Elisa Kit(批號13051201)；美國R&D公司(進口分裝)，Rat-Aromatase Elisa Kit(批號13051201)；美國ADL公司，Rat Cyclooxygenase-2 Elisa Kit(批號RT130371)。

1.3 動物

SPF級雌性SD大鼠，體質量200～250 g，成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(實驗動物合格證號SCXK(川)2004-12)。

1.4 儀器

德國HERA cell CO2培養(yǎng)箱，Thermo Labsystems Multiskan MK3全自動酶標儀，Heal Force公司HFsafe-1200型Safety Cabinet。

2 方法

2.1 體內實驗研究

2.1.1 分組 設模型對照組、去勢組、陽性對照組(來曲唑片，相當于成人劑量的7倍，具體劑量見后表)及內異康復片高、中、低3個劑量組(相當于成人劑量的14倍、7倍、3.5倍，具體劑量見后表)，每組各10只動物。

2.1.2 實驗方法 雌性SD大鼠60只，適應性飼養(yǎng)2周，監(jiān)測大鼠動情周期，在大鼠動情周期的動情期進行手術造模。按參考文獻方法[4]無菌條件下進行，采用5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠固定于手術臺上，從尿道上端約1 cm處切開皮膚肌肉約3 cm，取出一側子宮，結扎子宮兩端血管，剪下一段子宮放入生理鹽水中將剖開，剝去肌層留下子宮內膜，將5 mm×5 mm的子宮內膜縫在血管豐富的腹壁(其表面對著腹壁)并縫合切口。術后肌注慶大霉素防止感染，常規(guī)飼養(yǎng)。術后從第3周起開始進行藥物干預，即除模型組外，各組給予內異康復片或來曲唑片灌胃每日1次(模型空白組和去勢組給予等體積生理鹽水灌胃)，持續(xù)3周。末次給藥后24 h，大鼠眼眶取血分離血清，采用ELISA法檢測血清中E2、ARO、COX-2水平(ELISA檢測操作按試劑盒說明書進行)。

2.2 體外實驗研究

2.2.1 異位內膜細胞體外培養(yǎng)方法 EM模型大鼠造模方法同前，造模3周后再次打開大鼠腹腔，將異位的內膜組織取出，此時異位內膜成囊泡狀，囊泡內可見淡黃色透明積液者為造模成功的異位內膜組織。按文獻方法[5]，將大鼠異位內膜組織置于冰盒上剪碎至糊狀，置入離心管中加入5倍體積的膠原酶I(2 g/L)，37 ℃消化1 h(其間30 min時吹打1次)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吸取細胞懸液。800 r/min，離心3 min后棄上清，加入無血清DMEM培養(yǎng)基重新吹打后，再次離心棄上清，最后將沉淀的細胞中加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，稀釋成1×106/ml濃度的單細胞懸液，接種到24孔板上，置37 ℃ 5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。待大部分細胞貼壁后，設細胞空白對照組、藥物干預組，每組均設4個復孔。細胞空白對照組用等體積DMEM培養(yǎng)液代替受試藥物，藥物干預組加入不同濃度的藥物，每個濃度設4個復孔，藥物作用48 h后(藥物具體濃度見后表)收集細胞上清液，ELISA檢測E2、ARO、COX-2水平(ELISA檢測操作按試劑盒說明書進行)。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用《中國醫(yī)學百科全書·醫(yī)學統(tǒng)計學》統(tǒng)計軟件PEMS3.1進行統(tǒng)計分析。

3 結果

3.1 內異康復片對EM模型大鼠血清中E2、ARO、COX-2水平的影響

表1 內異康復片對EM模型大鼠血清中E2水平的影響

注：模型對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

表1顯示，與模型組比較，內異康復片高、中劑量組使EM模型大鼠血清中E2水平明顯下降(P<0.01或P<0.05)；內異康復片高劑量組使EM模型大鼠血清中ARO水平明顯下降(P<0.05)，內異康復片中、低劑量也有一定的降低趨勢；內異康復片高、中劑量組血清中COX-2水平明顯下降(P<0.05)，其他各組無明顯影響。

3.2 內異康復片對大鼠異位內膜細胞分泌的E2、ARO、COX-2水平的影響

表2顯示，與細胞空白對照組比較，內異康復片在各個劑量下使EM模型大鼠異位內膜細胞分泌的E2水平明顯下降(P<0.01或P<0.05)；內異康復片在0.05 ml/L使異位內膜細胞分泌的ARO水平明顯下降(P<0.05)；內異康復片在各個劑量下使異位內膜細胞分泌的COX-2水平明顯下降(P<0.01或P<0.05)，而其他組無明顯影響。

表2 內異康復片對EM模型大鼠異位內膜細胞分泌E2水平的影響

注：細胞空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

4 討論

內異康復片是成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院多年來治療EM頗具特色的婦科重點院內制劑，該方以我校附屬醫(yī)院婦科治療內膜異位癥的驗方為基礎，后不斷結合婦科臨床治療該病經(jīng)驗反饋精心研制而成。內異康復片曾先后被命名為化瘀止痛片、消瘤片2號，該方由大血藤、半枝蓮、桃仁、土鱉蟲、鱉甲、三棱、莪術、薏苡仁等藥物組成。方中大血藤敗毒抗癌、活血通絡，半枝蓮具有清熱解毒、散瘀活血作用，桃仁活血祛瘀，土鱉蟲、鱉甲破血祛瘀，三棱、莪術破血行氣，薏苡仁健脾滲濕，全方共奏清濕化瘀、行氣止痛、消癥散結之效，是以活血化瘀治療EM的驗方。該制劑在我院臨床使用時間已長達30余年，患者數(shù)萬人，取得了肯定的療效。但長期以來，對其現(xiàn)代機理的研究尚顯不足。本課題在四川省中醫(yī)藥管理局應用基礎科研基金的資助下，課題組從EM的現(xiàn)代機理入手，從體內外兩方面較為系統(tǒng)地考察了內異康復片對EM模型動物的影響。體內實驗研究采用手術方法建立EM模型大鼠，研究了內異康復片對該病模型大鼠E2、ARO、COX-2水平的影響；體外實驗研究采用細胞培養(yǎng)的方法，直接觀察藥物對異位內膜細胞分泌E2、ARO、COX-2的影響，同時在實驗中選用作用機理明確的現(xiàn)代藥物來曲唑對照觀察。由于動物血清本身含有較多的生物活性物質，可刺激細胞的生長，故在本次體外實驗研究中，我們未采用含藥血清進行研究。

芳香化酶(Aromatase，ARO)是雌激素生物合成過程中最后一步的限速酶，屬于細胞色素P450超家族，其過度表達于子宮內膜癌、乳腺癌、子宮平滑肌瘤等雌激素依賴性疾病中。芳香酶在EM組織中異常表達，局部組織雌激素濃度升高，從而促進異位內膜生長[6～8]。因此，如果能夠抑制芳香化酶活性，即可抑制E2的生成水平。由于現(xiàn)代藥物來曲唑有此功效，故在研究中我們選擇它為陽性對照藥物。

本次研究結果發(fā)現(xiàn)，內異康復片可明顯降低EM模型大鼠血清中E2水平(P<0.05，P<0.01)，體外實驗也表現(xiàn)出相似的結果，且藥效呈濃度依賴性關系，該作用與來曲唑相似。研究同時發(fā)現(xiàn)，內異康復片降低E2水平的機理也與其抑制芳香化酶直接相關。

通過本次實驗發(fā)現(xiàn)，在抑制芳香化酶活性從而降低E2生成水平這方面的作用機制上，內異康復片具有與來曲唑相似的作用和功效。但內異康復片與來曲唑也有明顯的不同之處，即內異康復片同時具有一定的抑制2型環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase-2，COX-2)的作用。目前在EM的發(fā)病過程中，有學者認為COX-2也參與了雌激素的生物合成，發(fā)現(xiàn)EM中芳香化酶mRNA與COX-2 mRNA的表達水平呈正相關，表明芳香化酶與COX-2協(xié)同作用導致EM病灶局部雌激素合成增加，促進EM的發(fā)生發(fā)展[9]。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，內異康復片也具有明顯的抑制COX-2活性的作用(P<0.05)，而這一作用與來曲唑明顯不同。

綜上所述，內異康復片不僅可降低EM模型大鼠血清中E2水平，其機制與抑制E2生成的關鍵酶芳香化酶有關，同時內異康復片還具有抑制COX-2酶活性的作用，反映出傳統(tǒng)中藥復方制劑內異康復片在臨床上可以具有多環(huán)節(jié)、多靶點發(fā)揮治療EM作用的特點，該研究為內異康復片更好地運用于臨床提供了科學的實驗研究依據(jù)。

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