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    液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬配合飼料中吉他霉素

    2014-02-08 08:14:04楊琳芬饒輝符金華趙薇娜
    江西畜牧獸醫(yī)雜志 2014年5期

    楊琳芬 饒輝 符金華 趙薇娜

    (農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南昌),江西 南昌 330029)

    液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬配合飼料中吉他霉素

    楊琳芬 饒輝 符金華 趙薇娜

    (農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南昌),江西 南昌 330029)

    采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定豬配合飼料中吉他霉素。試樣中的吉他霉素經(jīng)20/80(V/V)甲醇/水提取,取部分上清液稀釋,用美國waters公司生產(chǎn)的固相萃取柱(6cc/200mgOasisHLB)凈化,氮?dú)獯蹈?,初始流動相?fù)溶,上液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定,保留時間和離子豐度比定性,外標(biāo)法定量。本方法中吉他霉素檢測限為0.01mg/kg、定量限為0.05mg/ kg。吉他霉素的線性范圍為5~200ng/mL,相關(guān)系數(shù)r大于0.999。在0.05~50mg/kg的添加水平上,吉他霉素的平均回收率為63.3%~106.6%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%~10.3%。

    液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法;豬配合飼料;吉他霉素

    吉他霉素對革蘭氏陽性菌和某些陰性菌、支原體、立克氏體、螺旋體等有效,主要用于抗青霉素的葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌感染。吉他霉素是豬配合飼料中常用的飼料藥物添加劑,防治慢性呼吸系統(tǒng)疾病,促進(jìn)生豬的生長,提高生豬養(yǎng)殖效益。2001年農(nóng)業(yè)部第168號公告《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》規(guī)定,豬配合飼料中吉他霉素添加量:用于促進(jìn)生長,5~55mg/kg;用于防治疾病,80~330mg/kg,連用5~7d,休藥期7d。為了防止飼料生產(chǎn)企業(yè)和生豬養(yǎng)殖戶在豬配合飼料中超量添加,違法使用,開展豬配合飼料中吉他霉素的測定意義重大。

    1 原理

    飼料中的吉他霉素經(jīng)甲醇水提取,OasisHLB純化,初始流動相復(fù)溶,過0.45μm濾膜,上液質(zhì)測定,外標(biāo)法確證及篩查。

    2 樣品制備

    按照GB/T20195制備試樣,磨碎,全部通過0.28 mm孔篩,混勻,裝入密閉容器中。

    3 儀器設(shè)備

    AB104-N電子天平、Agilent6410BQQQ液質(zhì)聯(lián)用儀、HITACHICRG離心機(jī)。

    4 操作步驟

    4.1 試樣提取

    精確稱取試樣2g于250mL錐形瓶中,準(zhǔn)確加入20mL提取液(甲醇+水=20+80),振蕩30min,轉(zhuǎn)入離心管中,10000r/min離心5min,上清液備用。

    4.2 樣品純化

    固相萃取柱(6cc/200mgOasisHLB)分別用3 mL甲醇和3mL水活化,準(zhǔn)確移取5mL上清液過柱,清洗1:3mL5%甲醇及2%乙酸;清洗2:3mL5%甲醇及2%氨水;清洗3:3mL65%甲醇及2%氨水,近干后用甲醇洗脫,收集洗脫液。在氮吹裝置上50℃下用氮?dú)獯蹈?,?zhǔn)確加入1mL初始流動相(乙腈+0.1%甲酸水=90+10)復(fù)溶,過0.45μm微孔濾膜,上LC-MS/MS測定。上機(jī)液中的藥物濃度應(yīng)稀釋在線性范圍內(nèi)。

    4.3 測定

    4.3.1 液相色譜條件。色譜柱:AgilentZORBAXSBC182.1×100mm,1.8μm;柱溫:30℃;流動相:A:0.1%甲酸水溶液;B:0.1%甲酸乙腈,梯度洗脫條件見表1。

    4.3.2 質(zhì)譜條件。離子源:電噴霧離子源;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測MRM。使用前,應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量,以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求。質(zhì)譜參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最佳。定性離子對、定量離子對及碰

    撞能量的參考值見表2。

    表1 流動相梯度洗脫條件min,%

    表2 定性、定量離子對及碰撞能量的參考值m/z,V

    4.3.3 定性測定。在相同試驗條件下,樣品中待測物的

    保留時間與標(biāo)準(zhǔn)工作液的保留時間偏差在±2.5%之內(nèi),并且樣品圖譜中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近標(biāo)準(zhǔn)工作液中對應(yīng)的定性離子對的相對豐度進(jìn)行比較,若偏差不超過表3規(guī)定的范圍,則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測物。

    4.3.4 定量測定。按照上述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以色譜峰面積進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)校正定量,樣品溶液中待測物的響應(yīng)值應(yīng)在儀器規(guī)定的線性范圍內(nèi)。上述色譜和質(zhì)譜條件下,對照品的工作曲線圖、對照品的色譜質(zhì)譜圖和樣品的色譜質(zhì)譜圖見圖1~3。

    圖1 吉他霉素液質(zhì)對照品的工作曲線圖

    圖2 吉他霉素對照品的色譜質(zhì)譜圖

    圖3 吉他霉素樣品的色譜質(zhì)譜圖

    5 結(jié)果計算

    試樣中某種待測物的含量X以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/ kg)表示,按式(1)計算。

    式中:

    m1—計算機(jī)外標(biāo)法自動計算所得到的某待測物的質(zhì)量,單位為微克(μg);

    m—試樣質(zhì)量,單位為克(g);

    n—稀釋倍數(shù)。

    測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

    6 重復(fù)性

    同一分析者對同一試樣同時兩次平行測定結(jié)果的相對偏差不大于20%。

    7 結(jié)果分析

    采用液質(zhì)聯(lián)用儀篩查確證豬配合飼料中吉他霉素等常用的飼料藥物添加劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳豬奶粉、乳豬人工乳、乳豬料、仔豬料和小豬料、中豬料、大豬料和生長育肥豬后期料均含有吉他霉素。樣品純化應(yīng)采用美國waters公司生產(chǎn)的固相萃取柱(6cc/200mg OasisHLB),按優(yōu)化的OasisHLB程序進(jìn)行純化,這樣提取的上機(jī)液純度高,基質(zhì)干擾少。

    1004-2342(2014)05-0013-02

    S816.17

    B

    2014-07-31)

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