β－環(huán)糊精對多菌靈的熒光增敏效應(yīng)研究

姜慧明，楊 紅

(大連民族學(xué)院a.生命科學(xué)學(xué)院;b.環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連 116605)

β－環(huán)糊精是一種具有疏水空腔和親水表面的超分子主體化合物，具有分子識別功能，能夠選擇性地結(jié)合有機分子形成主客體超分子化合物。β－環(huán)糊精超分子包合物具有許多特點，比如溶解性能、化學(xué)性能、pKa值、擴散性能、電化學(xué)性能以及光化學(xué)性能等［1］。目前認為，β－環(huán)糊精引起熒光增強的主要因素是增加發(fā)射速度常數(shù)，減少分子移動自由度，避免去活碰撞，保持適宜的微環(huán)境以及保護激發(fā)態(tài)不與大體積水分子和猝滅劑接觸。段云青等［2］通過實驗數(shù)據(jù)推測，溴敵隆結(jié)構(gòu)中的疏水基團4－羥基香豆素母環(huán)或者溴代聯(lián)苯基進入了β－環(huán)糊精的疏水空腔之中，形成超分子包絡(luò)物引起熒光顯著增強，這為環(huán)糊精熒光增強機理的研究提供了必要的依據(jù)。但是目前對其熒光增敏機理的研究還基本處于推測階段。

多菌靈(carbendazim)，化學(xué)名稱為N－(2－苯駢咪唑基)－氨基甲酸甲酯，又名棉萎靈、苯井咪唑44號，結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 多菌靈的結(jié)構(gòu)

多菌靈是一種高效低毒內(nèi)吸性殺菌劑，對農(nóng)作物具保護和治療作用。對子囊菌亞門、半知菌亞門病原真菌有效，對鞭毛菌亞門真菌和細菌無抑制活性，可用于防治禾谷類作物、棉花、油菜和其他作物的多種病害。多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能被植物的種子、根和葉吸收，殘效期較長，對人、畜均有一定毒性，可引起抽搐、精神恍惚、惡心嘔吐、胸悶、頭暈等中毒癥狀。因此，有關(guān)多菌靈殘留量的分析已經(jīng)越來越受到重視。

雖然多菌靈在農(nóng)作物病害的防治方面有著廣泛的應(yīng)用，但對人體又有一定的毒害性，目前世界許多國家都制定了多菌靈在不同種(類)農(nóng)副產(chǎn)品中殘留量的最高限量標準。加拿大國家標準規(guī)定黃瓜、西葫蘆等蔬菜中多菌靈殘留量每公斤不得超過0.5 mg;馬來西亞規(guī)定蔬菜類中多菌靈殘留量每公斤不得超過1 mg;中國衛(wèi)生標準GBl4870－94中規(guī)定蔬菜、水果中多菌靈殘留量每公斤不得超過 0.5 mg。

多菌靈的測定目前主要采用液液萃取法［3］、固相萃取法［4－5］和二氧化碳超臨界萃取法［6］等;測定方法主要有分光光度法［7］、毛細管電泳法［4］、氣相色譜法［8］、液相色譜法及液相色譜質(zhì)譜法［9］等，熒光法尚未進行深入研究。

本文探討了多菌靈的熒光光譜，以及在β－環(huán)糊精存在下多菌靈的熒光增強效應(yīng)，旨在建立一種快速高效的熒光測定多菌靈含量的方法，為以β－環(huán)糊精作為超分子主體化合物對客體分子的熒光增敏效應(yīng)研究提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

儀器:RF－5301PC熒光分光光度計(SHIMADZU，日本)。

試劑:多菌靈，純度99.9%(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院農(nóng)藥研究室友情贈送)，配成0.08 mg·mL－1的乙醇/水溶液;β－環(huán)糊精(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，二次重結(jié)晶，60℃真空干燥后配成0.01mol·L－1水溶液;羥丙基環(huán)糊精(HPCD，上海源葉生物科技有限公司)，二次重結(jié)晶，60℃真空干燥后配成0.01 mol·L－1水溶液。實驗用水為二次蒸餾水。

Britton－Robinson(B－R)緩沖溶液的配置:取 H3BO30.6183 g，85% 的 H3PO40.68 mL，36%的乙酸1.16 mL，用蒸餾水配成250 mL的三酸混合液;再取2.0 g NaOH，配置成0.2 mol·L－1溶液，將配好的三酸混合液與NaOH溶液以不同體積混合，可配置成不同pH的B－R緩沖溶液。

1.2 方法

移取一定量的多菌靈溶液，加入不同量的B－R緩沖溶液及β－環(huán)糊精或HPCD溶液后移入25 mL比色管中，加水定容，室溫下振蕩10 min，然后測定溶液的相對熒光強度。

2 結(jié)果與討論

多菌靈的激發(fā)和發(fā)射譜如圖2，確定測定波長λex/em=284/306 nm。

圖2 多菌靈的激發(fā)和發(fā)射譜(狹縫寬度均為5 nm)

2.1 β－環(huán)糊精濃度的影響及包合常數(shù)測定

在確定了多菌靈的激發(fā)和發(fā)射波長后，筆者在多菌靈溶液中加入了不同濃度的β－環(huán)糊精，得到了一系列熒光光譜，見表1和圖3。

表1 不同β－環(huán)糊精濃度下多菌靈的熒光強度

圖3 不同β－環(huán)糊精濃度下多菌靈的熒光發(fā)射光譜(狹縫寬度均為5 nm)

β－環(huán)糊精濃度對多菌靈熒光強度的影響如圖4。

圖4 β－環(huán)糊精濃度對多菌靈熒光強度的影響

由表1和圖3、圖4可以清楚看出，多菌靈溶液在加入β－環(huán)糊精后，熒光強度有了明顯的增強。在β－環(huán)糊精的濃度范圍為8×10－4～5.6×10－3mol·L－1，多菌靈的熒光強度隨著 β － 環(huán)糊精濃度的增加而增強，繼續(xù)增加β－環(huán)糊精的濃度，熒光強度呈下降趨勢。

β－環(huán)糊精對多菌靈的的熒光增敏作用是由于多菌靈在疏水作用、范德華力及氫鍵力等非共價鍵作用的驅(qū)動下，進入β－環(huán)糊精空腔形成超分子包合物，在空腔內(nèi)多菌靈分子的運動自由度以及水分子的松弛效應(yīng)大大降低，阻止了碰撞失活，減少了非輻射躍遷的幾率;環(huán)糊精空腔所提供的非極性微環(huán)境近似于有機介質(zhì)［10］，使多菌靈分子的熒光在β－環(huán)糊精空腔中受到保護和屏蔽，減少了與腔體外主體溶液中水分子、氧等碎滅劑的接觸;空腔尺寸大小與極性對客體進行選擇性識別包結(jié)。據(jù)此，本實驗建立了水溶液中高靈敏度與高選擇性測定多菌靈的熒光光譜法。

假設(shè)在β－環(huán)糊精包合體系中，主客體的化學(xué)計量比為1∶1，即S+CD?CD－S，則包合物的形成常數(shù) K=［CD － S］/［S］［CD］，其中［S］［CD］［CD－S］分別表示客體S、主體CD和包合物CD－S的平衡濃度。根據(jù)Benesi－Hildebrand的雙倒數(shù)法，得到如下公式:

式中，F(xiàn)指在不同β－環(huán)糊精濃度下分別測得的熒光強度;F0指不加β－環(huán)糊精，多菌靈溶液測得的熒光強度;F∞指所有的多菌靈完全被β－環(huán)糊精環(huán)糊精包合后，測得的熒光強度。一般控制CD濃度遠大于S濃度，因此［CD］可用其原始濃度表示。

將所得實驗數(shù)據(jù)按1/(F－F0)對1/［CD］作圖，可得一線性關(guān)系較好的直線(R=0.992 7)，說明主客體間形成了1∶1的超分子包合物。由直線的截距與斜率之比可求得β－環(huán)糊精－多菌靈的結(jié)合常數(shù) K=3.2 ×102(L·mol－1)，如圖5。

圖5 β－環(huán)糊精－多菌靈一元包合物關(guān)系式方程曲線

假設(shè)在環(huán)糊精包合物中，主客體的化學(xué)計量比為2∶1，則 S+2β －CD?(β －CD)2－S。

將測得的實驗數(shù)據(jù)按1/(F－F0)對1/［CD］2作圖，不呈直線(如圖6)，因此主客體的化學(xué)計量比不是2∶1。

圖6 β－環(huán)糊精－多菌靈二元包合物關(guān)系式方程曲線

2.2 pH值對多菌靈熒光強度的影響

β－環(huán)糊精對堿穩(wěn)定，但在強酸性介質(zhì)中將分解為由開環(huán)產(chǎn)物直至葡萄糖組成的混合物。本文探討了pH=2.0～10.0范圍內(nèi)β－環(huán)糊精與多菌靈包結(jié)及其對熒光強度的影響，結(jié)果如圖7。體系的pH值是由B－R緩沖溶液來調(diào)節(jié)的。

圖7 pH值對β－環(huán)糊精包結(jié)多菌靈熒光強度影響的工作曲線

由圖7可以看出，在中性、弱酸性、弱堿性條件下，β－環(huán)糊精包結(jié)多菌靈的熒光強度都很強，其中以pH=7.6的溶液熒光強度最大。在強酸性溶液中(pH=2.29～4.06)，多菌靈的熒光強度發(fā)生了很大變化，306 nm處的發(fā)射峰基本消失了，這預(yù)示著多菌靈的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。由多菌靈的結(jié)構(gòu)可以看出，多菌靈在酸性溶液中會變成銨鹽，從而改變了其熒光吸收性質(zhì)。本實驗選擇pH=7.6作為熒光測定的最佳pH值。

2.3 工作曲線、檢測下限和精密度

由表1看出，當(dāng)β－環(huán)糊精的濃度為5.6×10－3mol·L－1時，多菌靈的熒光強度最大，因此在測定多菌靈的工作曲線時，固定β－環(huán)糊精的濃度為5.6 ×10－3mol·L－1而改變多菌靈的質(zhì)量濃度，得到了多菌靈在不同質(zhì)量濃度時的熒光強度，見表2和圖9。

表2 多菌靈不同濃度時的熒光強度(固定 β －環(huán)糊精的濃度為 5.6×10－3mol·L－1)

圖8 不同濃度多菌靈的熒光強度曲線(狹縫寬度均為5 nm)(譜圖自下而上編號依次為15，14，13…10)

圖9 多菌靈的工作曲線

由圖9可以看出，多菌靈在0.46～6.16 ng·mL－1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為F=5.37 C(ng·mL－1)+148.54，相關(guān)系數(shù)為0.999 3。依照 IUPAC規(guī)定，CL=kS0/S，其中 CL為檢測下限，k為與置信水平相關(guān)的常數(shù)，S0為n次空白溶液測定值的標準偏差(S0=0.11)，S為標準工作曲線的斜率。當(dāng)置信水平為90%時k取3，計算求得本法的檢測限為0.06 ng·mL－1。0.77 ng·mL－1多菌靈標準溶液9次平行測得值的相對標準偏差為1.2%。

3 結(jié)論

本文討論了多菌靈在與β－環(huán)糊精包合后的熒光光譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH=7.6的溶液中，β－環(huán)糊精對多菌靈具有很強的熒光增強效應(yīng)，且形成了1∶1的超分子體系，包合常數(shù)K=3.2×102(L·mol－1)。隨著熒光強度的增強，該體系對多菌靈的檢測限也大大提高，達到了60 pg·mL－1，是目前已經(jīng)發(fā)表的最好結(jié)果 4.78 ng·mL－1［11］的百分之一，該研究結(jié)果對提高農(nóng)藥殘留檢測靈敏度具有比較重要的應(yīng)用價值。

［1］申健.新型β－環(huán)糊精衍生物的合成及應(yīng)用［D］.濟南:山東大學(xué)，2008.

［2］段云青，閔順耕.殺鼠劑溴敵隆和環(huán)糊精的超分子作用及分析應(yīng)用［J］.分析實驗室，2009，28(5):1－5.

［3］余向陽，駱愛蘭，劉賢進.小麥中多菌靈殘留量的HPLC分析方法研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)藥，2004，3(1):17.

［4］DA SILVA C L，DE LIMA E C，TAVARES M F.Investigation of preconcentration strategies for the trace analysis of multi－residue pesticides in real samples by capillary electrophoresis［J］.J Chromatogr A，2003，1014(1/2):109.

［5］HU Y，YANG X，WANG C，et al.A sensitive determination method for carbendazim and thiabendazole in apples by solid－phase microextraction－h(huán)igh performance liquid chromatography with fluorescence detection［J］.Food Addit Contam，2008，25(3):314.

［6］ANASTASSIADES M，SCHWACK W.Analysis of carbendazim，benomyl，thiophanate methyl and 2，4－dichlorophenoxyacetic acid in fruits and vegetables after supercritical fluid extraction［J］.J Chromatogr A，1998，825(1):45.

［7］GARCIA R J，ORTEGA B P，MOLINA D A.Gel－surface enhanced fluorescence sensing system coup led to a continuous－flow assembly for simultaneous monitoring of benomyl and carbendazim［J］.Analyt Chim Acta，2003，493(1):35.

［8］李貝妮，王亞平，賈金平.水果中多菌靈的衍生碳纖維固相微萃取氣相色譜測定法［J］.環(huán)境與健康雜志，2008，25(3):255.

［9］蘇永恒，張榕杰，冶保獻.固相萃?。咝б合嗌V－質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定蔬菜、水果中多菌靈［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2010，45(3):490 －493.

［10］MA L，TANG B，CHU C.Spectrofluorimetric study of the β－cyclodextrin–dapsone–linear alcohol supramolecular system and determination of dapsone［J］.Analytic Chimica Acta，2002，469(2):273 －283.

［11］蔣新田，丁明.多菌靈的熒光法測定研究［J］.分析化學(xué)，1989，10:267 －269.

(責(zé)任編輯 鄒永紅)