大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種mtDNA COⅠ序列的分析

大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種mtDNA COⅠ序列的分析

采用PCR技術(shù)對大口黑鱸Micropterus salmoides北方亞種 (21尾）和佛羅里達亞種 (19尾）的mtDNA COⅠ區(qū)段進行擴增，得到約1400 bp的擴增片段，經(jīng)測序獲得了堿基排列順序清晰的1337 bp片段。北方亞種個體間沒有變異，只檢測到1種單倍型，與GenBank中大口黑鱸全序列 (DQ536425）中的COⅠ區(qū)段相應(yīng)部位比對，有5個堿基出現(xiàn)置換;佛羅里達亞種檢測到5種單倍型，19個個體與本研究中的北方亞種比對，有41個堿基出現(xiàn)完全置換。將6種單倍型的序列提交GenBank后獲得序列號為KF176376～KF176381，運用Mega 4.0軟件計算兩個亞種的堿基組成和堿基差異，北方亞種的單倍型多樣性指數(shù) (H）、核苷酸多樣性指數(shù) (Pi）和平均核苷酸差異性 (k）均為0，佛羅里達亞種的H、Pi、k分別為0.784、0.003 42和4.573，兩個亞種平均Kimura 2－parameter遺傳距離為0.0351。研究表明，大口黑鱸佛羅里達亞種mtDNA COⅠ區(qū)段的遺傳多樣性高于北方亞種，該序列可作為鑒別兩個亞種的DNA條形碼。

大口黑鱸;COⅠ序列;遺傳多樣性;遺傳距離;NJ系統(tǒng)樹

大口黑鱸Micropterus salmoides隸屬于鱸形目Perciformes、鱸亞目 Percoidei、太陽魚科 Centrarchidae、黑鱸屬 Micropterus，原產(chǎn)于北美地區(qū)，又稱加州鱸［1］。根據(jù)大口黑鱸的形態(tài)和地理分布可將其分為兩個亞種:北方亞種M.s.salmoides和佛羅里達亞種M.s.floridanus，北方亞種分布于美國中東部、墨西哥東北部、加拿大東南部，佛羅里達亞種分布于佛羅里達州南部［2－3］。大口黑鱸是肉食性魚類，肉質(zhì)鮮美，生長速度快，耐低溫，是重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一。中國大陸于1983年引入大口黑鱸，目前國內(nèi)大部分地區(qū)均有養(yǎng)殖［4］。

魚類線粒體 DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA）是一種環(huán)狀共價閉合的雙鏈DNA，具有自身轉(zhuǎn)錄RNA與翻譯蛋白質(zhì)的體系［5］。線粒體DNA呈母系遺傳、結(jié)構(gòu)簡單、分子量小、進化速度快且不發(fā)生重組，被廣泛應(yīng)用于物種起源、遺傳分化、種內(nèi)種間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和種類鑒定等方面［6－13］。與其他基因片段相比，線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ (cytochrome C oxidase subunitⅠ，COⅠ）基因有許多優(yōu)點，相對保守又有足夠的變異，并且序列長度適中。DNA條形碼技術(shù) (DNA Barcoding）是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析而進行物種鑒定的技術(shù)［14－15］。目前，線粒體COⅠ基因已成為研究動物DNA條形碼最重要的標準基因。Hebert等［14－15］對動物界 11 門 2238 個物種的COⅠ基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其序列間的差異能夠很好地區(qū)分所有研究物種，并認為在動物界中COⅠ基因是合適的DNA條形碼標準基因。本研究中，以大口黑鱸為材料，用PCR擴增COⅠ基因的部分區(qū)段并測序，比較分析亞種內(nèi)、亞種間的遺傳結(jié)構(gòu)差異，并構(gòu)建系統(tǒng)樹，旨在為兩個亞種的鑒別以及遺傳多樣性的分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用大口黑鱸北方亞種21尾，于2011年9月21日取自天津市天祥水產(chǎn)有限責任公司，體長為 (15.18±3.67）cm;大口黑鱸佛羅里達亞種19尾，于2012年1月11日由中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所提供，體長為 (16.34±2.26）cm。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 在鮮活狀態(tài)下，從每尾試驗魚體上剪取大小約1.0 cm×0.5 cm的鰭條，用苯酚－氯仿抽提法提取總基因組DNA，4℃下保存?zhèn)溆茫?6］。

1.2.2 mtDNA COⅠ基因區(qū)段的擴增及凝膠電泳依據(jù)GenBank登錄的大口黑鱸mtDNA全序列(DQ536425），參考文獻［17－22］中的 COⅠ序列通用引物和變異集中位置，通過Blast軟件比對確定相對保守的序列，利用Primer Premier 5.0軟件［23］設(shè)計引物。上游引物命名為 MSA5524:5'TCTATTTAGTATTTGGTGCTTGAG 3';下游引物命名為 MSA6972:5'GAGGAGGGCAGCCGTGAA 3'，兩個引物的結(jié)合位點均位于COⅠ基因區(qū)段內(nèi)。以提取的總基因組DNA為模板，使用所設(shè)計的引物對每尾試驗魚的COⅠ區(qū)段進行擴增，將PCR產(chǎn)物委托華大基因公司進行測序，依據(jù)峰圖確認，獲得堿基排列順序清晰的區(qū)段。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以GenBank中的大口黑鱸mtDNA全序列(DQ536425）為參考，用 CLUSTAL 1.83軟件［24］對測序結(jié)果進行同源序列比對分析，確定PCR擴增產(chǎn)物位于COⅠ區(qū)段內(nèi)。用DNAsp 4.0軟件［25］統(tǒng)計兩個亞種的單倍型數(shù)以及單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)、平均核苷酸差異性。用Mega 4.0軟件［26］統(tǒng)計每個個體所得區(qū)段的堿基組成和堿基差異，基于Kimura 2－parameter計算兩個亞種間的遺傳距離，并構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 大口黑鱸COⅠ區(qū)段的PCR擴增及測序

大口黑鱸兩個亞種mtDNA COⅠ區(qū)段的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，每個個體均得到約1400 bp的擴增片段 (圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)華大基因公司電泳、片段回收并測序。

圖1 大口黑鱸兩個亞種COⅠ區(qū)段PCR產(chǎn)物的電泳圖Fig.1 The electrophoresis of PCR product of COⅠregion in two subspecies of largemouth bass

2.2 測序結(jié)果分析

2.2.1 序列長度、單倍型和遺傳多樣性 用Contig Express Project軟件對雙向測序結(jié)果進行拼接，刪除測序起始部分峰圖雜亂的序列，獲得堿基排列順序清晰的1337 bp片段。與GenBank上的序列(DQ536425）比對后發(fā)現(xiàn)，獲得的片段是mtDNA COⅠ基因的部分序列，位于COⅠ基因的第110個～第1446個堿基處。北方亞種21尾個體間未見差異，只有1種單倍型，命名為N1，其單倍型多樣性指數(shù) (H）、核苷酸多樣性指數(shù) (Pi）和平均核苷酸差異性 (k）均為0;佛羅里達亞種19尾個體中有5種單倍型，分別命名為F1、F2、F3、F4和F5，5種單倍型中分別包含6、6、2、1、4個個體，佛羅里達亞種的 H、Pi和 k分別為0.784、0.003 42、4.573。將兩個亞種共6種單倍型的序列提交到GenBank，獲得的序列號為KF176376～KF176381。

2.2.2 兩個亞種的序列比較

(1）堿基組成與差異。用Mega 4.0軟件計算大口黑鱸兩個亞種測序得到COⅠ區(qū)段的堿基頻率(表1）。兩個亞種中A+T含量都高于G+C含量。堿基組成與魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等動物的mtDNA蛋白質(zhì)編碼基因的特征相同［27－28］。

兩個亞種魚序列結(jié)構(gòu)的差異性表現(xiàn)在亞種內(nèi)和亞種間兩方面，亞種間的差異性遠大于亞種內(nèi)(表2）。其中，北方亞種個體間未見差異，與GenBank中大口黑鱸的序列 (DQ536425）進行比對，有5個堿基出現(xiàn)置換;佛羅里達亞種個體間堿基變異較多，兩兩單倍型間出現(xiàn)1至8個堿基的差異，5個單倍型間共有11個堿基的差異。兩個亞種不同個體間存在52個堿基的差異，其中兩個亞種間完全不同的堿基有41個，可作為DNA－COⅠ條形碼來鑒定兩個亞種。

表1 大口黑鱸兩個亞種COⅠ區(qū)段序列的堿基頻率Tab.1 Nucleotide frequencies of COⅠregion in the two subspecies of largemouth bass %

(2）兩個亞種的遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)育樹?；贙imura 2－parameter(K2－P）計算兩亞種內(nèi)和亞種間COⅠ區(qū)段序列的遺傳距離 (表3）。結(jié)果表明，兩個亞種間的遺傳距離＞佛羅里達亞種內(nèi)遺傳距離＞北方亞種內(nèi)遺傳距離。

運用Mega 4.0軟件，基于Kimura 2－parameter模型，采用1000次抽樣重復(fù)檢測，將兩個亞種6種單倍型序列與GenBank中大口黑鱸序列(DQ536425）構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹。從圖2可以看出，GenBank中大口黑鱸序列與北方亞種 (N1）聚為一支，佛羅里達亞種 (F1～F5）聚為另一支。

表2 大口黑鱸兩個亞種COⅠ區(qū)段序列變異位點Tab.2 The variation sites of COⅠregion in the two subspecies of largemouth bass

表3 大口黑鱸兩個亞種COⅠ區(qū)段種內(nèi)和種間的平均K2－P遺傳距離Tab.3 The genetic distance of mtDNA COⅠregion in the two subspecies of largemouth bass based on Kimura 2－parameter model

3 討論

近年來，魚類mtDNA的研究逐步向序列分析的方向發(fā)展，序列遺傳多樣性分析及DNA條形碼已成為 COⅠ區(qū)的研究重點［18－22，27－28］。

圖2 基于Kimura 2－parameter模型構(gòu)建的大口黑鱸兩個亞種COⅠ序列的NJ樹Fig.2 NJ tree of COⅠregion in the two subspecies of largemouth bass based on the Kimura 2－parameter model

Lutz－Carrillo等［29］運用微衛(wèi)星DNA對大口黑鱸兩個亞種進行了檢測分析，認為佛羅里達亞種的遺傳多樣性高于北方亞種。李勝杰等［30］對線粒體DNA D－loop區(qū)段的序列分析結(jié)果表明，佛羅里達亞種的核苷酸多樣性指數(shù)高于北方亞種。本研究中應(yīng)用COⅠ序列分析，結(jié)果顯示，21尾北方亞種個體間沒有變異，19尾佛羅里達亞種不同個體間有變異存在，其H、Pi和k指數(shù)均大于北方亞種，表明佛羅里達亞種遺傳多樣性高于北方亞種。至于北方亞種的個體間沒有變異，遺傳多樣性指標均為0的可能原因:一是大口黑鱸引進時基礎(chǔ)群體數(shù)量較小，養(yǎng)殖過程中發(fā)生了近交和遺傳漂變等現(xiàn)象［30］;二是北方亞種物種本身的特性，即北方亞種是一個遺傳多樣性較低的類別，這與其他學者使用其他遺傳標記檢測的結(jié)果相似［29－31］。

大口黑鱸兩個亞種在形態(tài)上十分相似，較難區(qū)分，雖然二者的側(cè)線鱗數(shù)有所不同，北方亞種側(cè)線鱗數(shù)為59～68，佛羅里達亞種的側(cè)線鱗數(shù)為69～73，但由于測量時存在誤差，很難有效地鑒別兩個亞種［30，32］。Nedbal等［31］運用 RFLP 技術(shù)研究了兩個亞種的線粒體DNA，8種酶切結(jié)果表明，兩個亞種具有不同的單倍型。Williams等［33］運用 RAPD技術(shù)鑒定了兩個亞種，篩選出3個引物，擴增出15個特異性標記，可有效地鑒別兩個亞種。張大莉等［34］對兩個亞種做了同工酶檢測，發(fā)現(xiàn)兩個亞種在IDH－1*和MDH－2*兩個基因座位上的基因完全不同，可依此將兩個亞種完全分開。Li等［35］分析了采自中國3個養(yǎng)殖場共14尾北方亞種 (每個養(yǎng)殖場取4～5尾）和采自美國的5尾野生北方亞種與5尾佛羅里達亞種，研究了COⅠ區(qū)807 bp序列的單核苷酸多態(tài)性，認為兩個亞種的COⅠ有明顯區(qū)別。Hebert等［14－15］對包括脊索動物在內(nèi)的11個門類動物的2238個物種間的遺傳差異進行比較后，得到種內(nèi)遺傳距離大多數(shù)在1%以下，很少超過2%。由此認為，3%的遺傳距離可以作為種類鑒別的標準。本研究中，通過對兩個亞種COⅠ區(qū)段1337 bp的檢測分析，得到兩亞種間的Kimura 2－parameter遺傳距離為0.035 13，作者認為，依據(jù)COⅠ序列可有效地將大口黑鱸北方亞種與佛羅里達亞種分開。對大口黑鱸兩個亞種COⅠ序列的檢測分析，可為種類鑒別、遺傳多樣性分析和遺傳育種等研究提供參考依據(jù)。

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張大莉1，董仕1，白俊杰2，苗建發(fā)3，胡瑩1，李勝杰2，苗建新3，張興華1，馬冬梅2
(1.天津師范大學生命科學學院天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387;2.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州510380;3.天津市天祥水產(chǎn)有限責任公司，天津301500）

Sequence analysis of mtDNA COⅠregion in northern and Florida subspecies of largemouth bass Micropterus salmoides

ZHANG Da－li1，DONG Shi1，BAI Jun－jie2，MIAO Jian－fa3，HU Ying1，LI Sheng－jie2，
MIAO Jian－xin3，ZHANG Xing－h(huán)ua1，MA Dong－mei2
(1.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China;2.Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510380，China;3.Tianjin Tianxiang Fishery Company Limited，Tianjin 301500，China）

The PCR technology was used to amplify the mtDNA COⅠregion of 21 individuals of northern subspecies and 19 individuals of Florida subspecies of largemouth bassMicropterus salmoides，and about 1400 bp DNA fragments were obtained，in which the sequence of 1337 bp fragment were obtained by sequencing.Comparing with COⅠ region of mtDNA complete sequence of largemouth bass(GenBank:DQ536425），there were five base substitutions and the haplotype detected was only one within northern subspecies.There were five haplotypes within Florida subspecies，and the 41 bases substitution was detected in all individuals of Florida subspecies compare with northern subspecies.The six haplotypes has GenBank serial numbers from KF176376 to KF176381 and the base composition and base differences were calculated by Mega 4.0 software，with haplotype diversity index(H）of 0，nucleotide diversity index(Pi）of 0 and average nucleotide diversity(k）of 0 in northern subspecies.Florida subspecies has H of 0.784，Pi of 0.003 42 and k of 4.573.The two subspecies have average Kimura 2 － parameter genetic distance of 0.035 1.There was higher genetic diversity in mtDNA COⅠ region in Florida subspecies than in northern subspecies，indicating that the sequence of mtDNA COⅠ region can be used as a DNA barcode for identification of the two subspecies of largemouth bass.

Micropterus salmoides;COⅠregion;genetic diversity;genetic distance;NJ phylogenetic tree

S965.199;Q953

A

10.3969/J.ISSN.2095 －1388.2014.03.002

2095 －1388(2014）03 －0212 －05

2013－11－28

天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項目 (201104120）;科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化基金資助項目 (2012GB23260562）

張大莉 (1988—），女，碩士研究生。E－mail:913801465@qq.com

胡瑩 (1963—），女，副教授。E－mail:huying265@126.com