特應(yīng)性皮炎患兒外周血巨噬細(xì)胞游走抑制因子及IL-17和IL-23的表達(dá)及其相關(guān)性研究

馬 蕾，高梅蘭，薛海波，管秀好，舒春梅，張桂芹，運蓓蕾

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年4—11月在我院門診就診的36例AD患兒為病例組，其中男20例，女16例；年齡3～16歲，平均(9.9±3.7)歲；采用疾病的嚴(yán)重程度(SCORAD)評分[4]評價患兒疾病嚴(yán)重程度：中度26例(15分≤SCORAD評分<40分)，重度10例(SCORAD評分≥40分)；所有患兒于入組前1周停用抗組胺藥、外用糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑及免疫抑制劑，且6個月內(nèi)未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素及免疫相關(guān)制劑。選擇同期在我院體檢正常兒33例為對照組，其中男17例，女16例；年齡5～16歲，平均(10.8±3.2)歲。兩組受試者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.113,t=1.144,P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過，并由患兒監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 PBMCs的分離 所有受試者于8：00～9：00采集空腹外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，聚蔗糖(Ficoll)(ρ=1.077)密度梯度離心法分離PBMCs。

1.2.2 PBMCs中MIF、IL-17及IL-23 mRNA的表達(dá) 采用實時定量RT-PCR，Trizol RNA提取試劑(美國Invitrogen公司)提取PBMCs總RNA，紫外分光光度儀測定RNA純度，吸光度值(A260/A280)介于1.8～2.0，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性；采用PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，寶生物工程大連有限公司)合成cDNA第一鏈；設(shè)計MIF、IL-17和IL-23引物序列(見表1)，經(jīng)BLAST比對，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa，寶生物工程大連有限公司)于Rotor-Gene 3000 real-time PCR儀(澳大利亞Corvett Research公司)上進行定量檢測；檢測數(shù)據(jù)用Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0軟件和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行分析。

1.2.3 血清MIF、IL-17和IL-23水平 采用ELISA法檢測，所有受試者于8：00～9：00采集空腹外周靜脈血3 ml，2 390×g離心5 min后吸取血清，-70 ℃保存待測。MIF、IL-17和IL-23試劑盒均購自美國R&D公司，嚴(yán)格按照試劑盒操作要求進行檢測。

表1 MIF、IL-17、IL-23及β-actin引物序列

注：MIF=巨噬細(xì)胞游走抑制因子

2 結(jié)果

2.1 PBMCs中MIF、IL-17和IL-23 mRNA表達(dá)水平

2.1.1 RT-PCR曲線 目的基因(MIF、IL-17和IL-23)和內(nèi)參基因(β-actin)標(biāo)準(zhǔn)曲線直線擬合度良好，直線相關(guān)性好，可在較寬范圍內(nèi)進行定量分析(見圖1)；擴增曲線呈S型，整條曲線走行光滑，重復(fù)表現(xiàn)一致，擴增結(jié)果理想(見圖2)；熔解曲線表現(xiàn)為單峰，擴增特異性和重復(fù)性良好(見圖3)。

2.1.2 mRNA表達(dá)水平 病例組MIF、IL-17和IL-23 mRNA表達(dá)水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

2.2 血清MIF、IL-17和IL-23水平 病例組血清MIF、IL-17和IL-23水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

注：MIF=巨噬細(xì)胞游走抑制因子

圖1 β-actin、MIF、IL-17和IL-23 RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure1 The standard curve of β-actin，MIF，IL-17 and IL-23 by real-time RT-PCR

圖2 β-actin、MIF、IL-17和IL-23實時定量RT-PCR的擴增曲線

Figure2 The amplification curve of β-actin，MIF，IL-17 and IL-23 by real-time RT-PCR

2.3 相關(guān)性分析 線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，AD患兒PBMCs中MIF mRNA表達(dá)水平(r=0.418，P=0.011，見圖4A)及血清MIF水平(r=0.419，P=0.011，見圖4B)與SCORAD評分均呈正相關(guān)；PBMCs中MIF mRNA表達(dá)水平與IL-17 mRNA、IL-23 mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)(rIL-17 mRNA=0.395，P=0.017，見圖4C；rIL-23 mRNA=0.422，P=0.010，見圖4D)，血清MIF水平與IL-17、IL-23水平均呈正相關(guān)(rIL-17=0.407，P=0.014，見圖4E；rIL-23=0.375，P=0.024，見圖4F)。

圖3 β-actin、MIF、IL-17和IL-23實時定量RT-PCR的熔解曲線

Figure3 The melt curve of β-actin，MIF，IL-17 and IL-23 by real-time RT-PCR

Table2 Comparison of mRNA expression of MIF，IL-17 and IL-23 in PBMCs and serum levels between the two groups

組別例數(shù)mRNA表達(dá)水平MIF IL-17 IL-23血清水平MIF(μg/L) IL-17(ng/L) IL-23(ng/L)對照組331.83±0.691.77±0.510.92±0.22 9.80±2.21 11.71±2.0818.97±4.39病例組365.93±2.356.76±1.873.21±0.7334.92±8.7333.29±5.7054.62±9.69t值10.03915.40517.91516.67821.23819.940P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注：PBMCs=外周血單個核細(xì)胞

圖4 AD患兒MIF與疾病嚴(yán)重程度評分及IL-17、IL-23的相關(guān)性

Figure4 Correlation between MIF and SCORAD score，IL-17，and IL-23 in AD children

3 討論

MIF是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在多種變應(yīng)性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[7-10]。本研究結(jié)果顯示，病例組患兒PBMCs中MIF mRNA表達(dá)水平及血清MIF水平均高于對照組，且線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，AD患兒PBMCs中MIF mRNA表達(dá)水平及血清MIF水平均與SCORAD評分呈正相關(guān)。MIF與T淋巴細(xì)胞存在相互作用，活化的T淋巴細(xì)胞是MIF的主要來源，當(dāng)T淋巴細(xì)胞受到特異性抗原刺激后，T淋巴細(xì)胞中MIF mRNA表達(dá)水平和蛋白分泌量均明顯增多，應(yīng)用抗MIF抗體后抗原特異性T細(xì)胞的增殖受到明顯抑制[11]；反之，MIF又可促進T細(xì)胞的增殖及多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

綜上所述，MIF在AD患兒中高表達(dá)，且與IL-17、IL-23密切相關(guān)，炎性因子間的相互作用可能共同參與了AD的發(fā)生、發(fā)展。但本研究樣本量較小，且為單中心研究，各細(xì)胞因子間的作用途徑、方式及可能機制尚有待深入探討，這也是今后的研究重點和方向。

1 Koga C，Kabashima K，Shiraishi N，et al.Possible pathogenic role of Th17 cells for atopic dermatitis[J].J Invest Dermatol，2008，128(11)：2625-2630.

2 Ma L，Xue HB，Guan XH，et al.Possible role of Th17 cells and IL-17 in the pathogenesis of atopic dermatitis in northern China[J].J Dermatol Sci，2012，68(1)：66-68.

3 Stojanovic I，Cvjeticanin T，Lazaroski S，et al.Macrophage migration inhibitory factor stimulates interleukin-17 expression and production in lymph node cells[J].Immunology，2009，126(1)：74-83.

4 中華醫(yī)學(xué)會皮膚性病學(xué)分會免疫學(xué)組.中國特應(yīng)性皮炎診斷和治療指南[J].中華皮膚科雜志，2008，41(11)：772-773.

5 Rybojad M.Atopic dermatitis[J].Arch Pediatr，2012，19(8)：882-885.

6 吳瓊，吳侃，姜祎群.IL-23/Th17細(xì)胞/IL-17通路在皮膚科的研究進展[J].國際皮膚性病學(xué)雜志，2012，38(6)：393-396.

7 Yanagi T，Kodama K，Yoshihisa Y，et al.Macrophage migration inhibitory factor in zinc-allergic systemic contact dermatitis[J].Cytokine，2006，35(5/6)：270-274.

8 Nakamaru Y，Oridate N，Nishihira J，et al.Macrophage migration inhibitory factor(MIF)contributes to the development of allergic rhinitis[J].Cytokine，2005，31(2)：103-108.

9 Wang B，Huang X，Wolters PJ，et al.Cutting edge：deficiency of macrophage migration inhibitory factor impairs murine airway allergic responses[J].J Immunol，2006，177(9)：5779-5784.

10 Hamasaka A，Abe R，Koyama Y，et al.DNA vaccination against macrophage migration inhibitory factor improves atopic dermatitis in murine models[J].J Allergy Clin Immunol，2009，124(1)：90-99.

11 Baugh JA，Bucala R.Macrophage migration inhibitory factor[J].Crit Care Med，2002，30(1 Suppl)：S27-S35.

12 Bacher M，Metz CN，Calandra T，et al.An essential regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in T-cell activation[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(15)：7849-7854.

13 Wakashin H，Hirose K，Maezawa Y，et al.IL-23 and Thl7 cells enhance Th2-cell-mediated eosinophilic airway inflammation in mice[J].Am J Respir Crit Care Med，2008，178(10)：1023-1032.

14 蔡民強，酈斐，嚴(yán)淑賢，等.上海市長寧區(qū)新涇地區(qū)0～6歲兒童特應(yīng)性皮炎患病率的調(diào)查研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2012，15(6)：1880.