慢性腎衰竭模型中透明質(zhì)酸和CD44對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢及修復(fù)作用的影響

邊曉慧，何 平，孫廣萍，孫 立，李德天，馮江敏

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的歸巢是其在各種腎臟疾病中發(fā)揮作用的第一步。目前，大量證據(jù)表明，當(dāng)特定的組織器官受損后，外源性的MSC能夠優(yōu)先定位于受損靶器官的受損部位，包括心[1]、腦[2]、腎[3]等，并且與MSC進(jìn)入體內(nèi)的方式無關(guān)。目前，對(duì)于MSC歸巢的機(jī)制并不明確，假說認(rèn)為在受損的部位某種特異性的化學(xué)趨化因子或細(xì)胞因子較正常組織明顯升高，而MSC表達(dá)不同的黏附分子或趨化因子，其之間的相互作用促使MSC定向性地移動(dòng)、黏附、定植于受損部位，從而發(fā)揮對(duì)靶器官的保護(hù)作用。透明質(zhì)酸(HA)在很多腎臟疾病中都出現(xiàn)表達(dá)升高[4-6]，而其特異性配體是MSC的表面特異性受體CD44。Zhu等[7]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HA能劑量依賴性地刺激MSC的遷移，Herrera等[4]在甘油誘導(dǎo)的急性腎衰竭模型中發(fā)現(xiàn)MSC的確能夠遷移至HA表達(dá)明顯的區(qū)域。所以目前提出了新的觀點(diǎn)，即CD44和HA之間的相互作用可能是外源性MSC在體內(nèi)歸巢于受損腎臟的關(guān)鍵因素。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在大鼠5/6腎切除后的第8周給予尾靜脈注射MSC，不僅歸巢的數(shù)量較多，而且能夠修復(fù)受損的腎臟[8]。故本實(shí)驗(yàn)擬在該模型中進(jìn)一步研究MSC的歸巢是否也與CD44和HA之間的相互作用有關(guān)以及是否影響MSC修復(fù)腎臟的能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的大鼠MSC/GFP購(gòu)自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司(RASMX-01101)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年健康清潔級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量200～250 g，鼠齡7～8周，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物室提供。主要試劑：SD大鼠MSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RASMX-03011-440，廣州賽業(yè))，10% MSC專用胎牛血清(RASMX-05001-50，廣州賽業(yè))。兔抗大鼠透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(HABP)多克隆抗體(lifespan，USA)；小鼠抗大鼠HABP單克隆抗體(Bio-World，USA)；小鼠抗大鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體(武漢博士德試劑有限公司)；兔抗大鼠CD68多克隆抗體(武漢博士德試劑有限公司)；抗CD44抗體(OX50，Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)；小鼠抗綠色熒光蛋白標(biāo)簽單克隆抗體(Earth OX，LLC，San Francisco，CA，USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MSC的培養(yǎng)和CD44的表達(dá) MSC/GFP在SD大鼠MSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃ 5%CO2恒溫箱中進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。MSC能夠持續(xù)表達(dá)綠色熒光(見圖1A)，流式細(xì)胞儀分析MSC明顯表達(dá)CD44(圖1B)。

注：A為綠色熒光蛋白標(biāo)記的MSC；B為CD44在MSC的表達(dá)；MSC=間充質(zhì)干細(xì)胞

圖1 綠色熒光蛋白標(biāo)記的MSC表達(dá)CD44

Figure1 Expression of CD44in MSC labled by GFP

1.2.2 建立大鼠慢性腎衰竭模型 所有大鼠的實(shí)驗(yàn)步驟都經(jīng)過中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。應(yīng)用兩步法[9]建立大鼠慢性腎衰竭模型，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，先行右腎全切，1周后左腎切除2/3。假手術(shù)組只進(jìn)行麻醉和腎被膜剝離，而不進(jìn)行腎切除術(shù)。

1.2.3 MSC的治療 選取第二次術(shù)后8周仍存活的大鼠，根據(jù)體質(zhì)量由小到大編號(hào)，從隨機(jī)數(shù)字表上抄錄隨機(jī)數(shù)字，每個(gè)隨機(jī)數(shù)目除以4，利用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)法分為4組：假手術(shù)組(假手術(shù)大鼠尾靜脈注射1×107/ml MSC，n=8)、模型組〔5/6腎切除大鼠尾靜脈注射1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，n=8〕、MSC組(5/6腎切除大鼠尾靜脈注射1×107/ml MSC，n=8)和MSC/抗CD44組(5/6腎切除大鼠尾靜脈注射1×107/ml提前用抗CD44抗體OX50預(yù)孵的MSC，n=8)。治療4周后處死大鼠，留取血標(biāo)本和腎組織。

1.3 腎功能指標(biāo) 處死大鼠后收集血標(biāo)本，分離上清液，于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院檢驗(yàn)科應(yīng)用常規(guī)方法檢測(cè)血清肌酐和尿素氮，進(jìn)行腎功能的評(píng)估。

1.4 組織形態(tài)學(xué)分析 過碘酸雪夫(PAS)染色和Masson染色后觀察病理改變。采用半定量方法計(jì)算腎小球硬化指數(shù)[10]和腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)[11]，其中腎小球硬化定義為局灶或球性毛細(xì)血管袢的閉塞或玻璃樣變，腎小管間質(zhì)損傷的定義為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、小管萎縮/代償性擴(kuò)張和間質(zhì)纖維化。

1.5 免疫熒光法 應(yīng)用免疫熒光法進(jìn)行腎組織MSC追蹤，雙熒光法觀察MSC與HA的定位關(guān)系。冷凍切片10 μm，熱修復(fù)，5%脫脂奶粉封閉30 min，滴加小鼠抗綠色熒光蛋白標(biāo)簽單克隆抗體(1∶5 000)或兔抗大鼠HA結(jié)合蛋白抗體(1∶50)，PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，4 ℃過夜，避光滴加對(duì)應(yīng)的熒光二抗，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染核5 min，甘油封片，共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 免疫組化法 腎組織石蠟包埋，切片，脫蠟，熱修復(fù)，5%脫脂奶粉封閉，分別加入一抗:兔抗大鼠HA結(jié)合蛋白抗體(1∶50)，小鼠抗大鼠α-SMA抗體(肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記，1∶320)和兔抗大鼠CD68抗體(巨噬細(xì)胞標(biāo)記，1∶150)按ABC免疫酶染色(ABC)法進(jìn)行免疫組化染色，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)取10個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算積分光密度值(IOD)，取平均值。

1.7 免疫印跡法 稱取100 mg腎皮質(zhì)，提取總蛋白，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度，變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。不同的轉(zhuǎn)移膜分別加入不同一抗〔小鼠抗大鼠HA結(jié)合蛋白抗體(1∶300)和兔抗大鼠β-actin單克隆抗體1∶2 000〕4 ℃過夜，加入相應(yīng)的二抗，ECL顯色發(fā)光，電腦掃描拍照，圖像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度值。計(jì)算目的蛋白與β-actin光密度比值作為半定量指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 4組腎功能、腎小球硬化指數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較 4組肌酐、尿素氮、腎小球硬化指數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中與假手術(shù)組比較，模型組、MSC組、MSC/抗CD44組肌酐、尿素氮、腎小球硬化指數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，MSC組、MSC/抗CD44組肌酐、尿素氮、腎小球硬化指數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MSC組、MSC/抗CD44組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

Table1 Comparasion of renal function,glomerulosclerosis index and renal tubular mesenchymal damage index among 4 groups

組別例數(shù)肌酐(μmol/L)尿素氮(mmol/L)腎小球硬化指數(shù)腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)假手術(shù)組842 95±5 236 81±1 130 83±0 090 07±0 07模型組891 98±6 32?17 48±2 05?1 75±0 18?2 87±0 16?MSC組881 00±9 33?△10 36±1 73?△1 41±0 09?△2 59±0 29?△MSC/抗CD44組884 56±6 41?△11 51±1 81?△1 48±0 09?△2 62±0 29?△F值78 7553 58135 61351 94P值 0 00 0 00 0 00 0 00

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

2.2 MSC對(duì)腎組織病理的影響 PAS染色和Masson染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比(見圖2A、圖3A)，模型組的腎臟病理改變主要為腎小球肥大、腎小管上皮細(xì)胞濁腫變性，局灶系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增寬，局灶性腎小球毛細(xì)血管袢玻璃樣變、間質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，灶性間質(zhì)纖維化(見圖2B、圖3B)。MSC治療后上述病理改變均有所改善(見圖2C、圖3C)，提前用抗CD44抗體孵育的MSC治療4周后，上述病理改變亦得到改善(見圖2D、圖3D)。

2.3 腎組織中MSC追蹤 治療4周后，假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)有歸巢的MSC(見圖4A)，而在MSC組的殘腎組織中發(fā)現(xiàn)較多的MSC，主要定位于腎小管上皮細(xì)胞、血管周圍、腎間質(zhì)和部分腎小球內(nèi)(見圖4B)，而MSC/抗CD44組歸巢的MSC減少，尤其是腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)(見圖4C)。雙免疫熒光結(jié)果顯示較多MSC歸巢HA表達(dá)豐富的區(qū)域(見圖4D)。

2.4 腎組織中HA的表達(dá) HA在假手術(shù)組大鼠的腎皮質(zhì)幾乎不表達(dá)(見圖5A)，而髓質(zhì)有部分表達(dá)(見圖5B)，模型組大鼠受損腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中明顯分泌HA，在腎小球和腎間質(zhì)也有少量HA的表達(dá)(見圖5C)。免疫印跡法也證實(shí)模型組大鼠腎皮質(zhì)HA蛋白表達(dá)水平明顯增高(見圖5D)。

2.5 MSC對(duì)腎組織巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的影響 與假手術(shù)組相比(見圖6A、圖7A)，模型組大鼠的腎小球和間質(zhì)內(nèi)有大量巨噬細(xì)胞(CD68陽(yáng)性的細(xì)胞)浸潤(rùn)(見圖6B)，同時(shí)有明顯的肌成纖維細(xì)胞(α-SMA陽(yáng)性的細(xì)胞)堆積(見圖7B)，而提前用或不用抗CD44抗體預(yù)孵的MSC治療后均能明顯減少巨噬細(xì)胞(圖6C、D)和肌成纖維細(xì)胞(見圖7C、D)。

3 討論

目前研究證實(shí)無論是甘油[4]、順鉑[12]或缺血-再灌注[13]誘導(dǎo)的急性腎受損、還是免疫介導(dǎo)的[3]或非免疫介導(dǎo)的[14]慢性腎臟損傷中，外源性MSC均能歸巢于受損部位。Kunter等[3]給抗Thy1.1腎炎大鼠的左腎動(dòng)脈注入標(biāo)記的MSC，第4～10天20%～50%的腎小球都能夠發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的MSC，而將標(biāo)記的系膜細(xì)胞用同樣的方法注入，結(jié)果雙腎均未發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的MSC。本課題組在慢性馬兜鈴腎病大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射MSC后發(fā)現(xiàn)在損傷較為明顯的皮髓質(zhì)交界部位的腎小管和腎間質(zhì)內(nèi)有標(biāo)記的MSC[14-16]。類似的，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在5/6腎切除術(shù)后第8周尾靜脈注射MSC，治療4周后也發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的MSC歸巢于殘腎組織，主要定位于受損的腎小球、腎小管、腎間質(zhì)和管周毛細(xì)血管叢。

注：A為假手術(shù)組，B為模型組，C為MSC組，D為MSC/抗CD44組

圖2 腎組織的PAS染色(×400)

Figure2 PAS staining in kidney tissue

注：A為假手術(shù)組，B為模型組，C為MSC組，D為MSC/抗CD44組

圖3 腎組織的Masson染色(×400)

Figure3 Masson staining in kidney tissue

注：A為假手術(shù)組，B為MSC組，C為MSC/抗CD44組，D為MSC與HA在MSC組的共表達(dá)

圖4 免疫熒光法追蹤腎組織中MSC(×400)

Figure4 Tracking MSC in remnant kidney tissue by immunofluorescence

注：A為假手術(shù)組腎皮質(zhì)，B為假手術(shù)組腎髓質(zhì)，C為模型組腎皮質(zhì),D為免疫印跡法；HA=透明質(zhì)酸

圖5 腎臟HA免疫組化染色(×400)和腎皮質(zhì)HA免疫印跡法

Figure5 Expression of HA by immunohistochemical staining in kidney tissue and by Western blotting in renal cortex

注：A為假手術(shù)組，B為模型組，C為MSC組，D為MSC/抗CD44組

圖6 腎組織中CD68的免疫組化染色(×400)

Figure6 Expression of CD68by immunohistochemistry staining in kidney tissue

注：A為假手術(shù)組，B為模型組，C為MSC組，D為MSC/抗CD44組

圖7 腎組織中α-SMA的免疫組化染色(×400)

Figure7 Expression of α-SMA by immunohistochemistry staining in kidney tissue

目前，對(duì)于MSC歸巢的機(jī)制并不明確，認(rèn)為類似于炎性細(xì)胞向炎癥部位以及造血干細(xì)胞(HSC)向骨髓腔內(nèi)的趨化運(yùn)動(dòng)，是一個(gè)高度選擇的過程，在受損的組織存在某種特異性的化學(xué)趨化因子或細(xì)胞因子較正常組織明顯升高，通過與MSC表達(dá)的某種趨化因子的相互作用促使MSC定向性地移動(dòng)、黏附和定植于受損部位。既往研究已經(jīng)證實(shí)SDF-1-CXCR4的相互作用是目前已知的HSC歸巢最強(qiáng)大的趨化劑[17]，但史明霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)大部分的MSC表面幾乎檢測(cè)不到CXCR4的表達(dá)，故提示MSC和HSC的歸巢機(jī)制可能不一樣。HA為一種線性非硫酸化糖胺聚糖，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，其在正常腎髓質(zhì)內(nèi)含量豐富，而在腎皮質(zhì)中幾乎完全缺乏，但是在很多急慢性腎臟損傷中都發(fā)現(xiàn)腎臟皮質(zhì)大量表達(dá)HA[4-6]。相似的，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)5/6腎切除術(shù)后的腎皮質(zhì)中大量表達(dá)HA，主要由擴(kuò)張的腎小管上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的腎間質(zhì)分泌，提示與腎臟受損密切相關(guān)。大多數(shù)MSC表面均表達(dá)HA的特異性配體CD44，本研究所用的MSC經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析表面標(biāo)記也證實(shí)了這一點(diǎn)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HA能劑量依賴性地刺激MSC的遷移，這種遷移能力可以被單克隆抗CD44抗體所抑制[7]。Herrera等[4]在甘油誘導(dǎo)的急性腎衰竭模型研究中發(fā)現(xiàn)MSC遷移至HA表達(dá)明顯的區(qū)域，能夠促進(jìn)受損部位的形態(tài)學(xué)和功能的恢復(fù)，但如果給予用抗CD44抗體預(yù)處理的MSC或CD44-/-的MSC或只表達(dá)CD44但無CD44功能的MSC則都不能遷移至受損組織，結(jié)果證實(shí)HA-CD44的相互作用是MSC歸巢于急性腎臟損傷的主要原因。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗CD44特異性的抗體阻斷與HA的結(jié)合能力后，歸巢于殘腎組織的MSC也明顯減少，同時(shí)雙熒光分析大部分歸巢的MSC位于HA表達(dá)豐富的區(qū)域，所以本研究結(jié)果提示HA-CD44的相互作用在慢性腎衰竭模型中也參與了MSC的歸巢。

與Herrera等[4]研究結(jié)果不同的是，應(yīng)用抗CD44抗體雖然阻斷了HA與CD44的相互作用，但并不能完全阻斷MSC的歸巢，同時(shí)還依然能夠改善殘腎功能，減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和延緩腎纖維化的發(fā)生，解釋這些現(xiàn)象可能的原因有：(1)本研究雙熒光結(jié)果顯示并不是所有歸巢的MSC都定位于HA表達(dá)豐富的區(qū)域，這說明HA-CD44的相互作用并不是惟一引起MSC在慢性腎衰竭模型中歸巢的趨化劑。近期研究發(fā)現(xiàn)人的MSC表面還存在其他一系列的趨化因子的受體，如CCR-CXCL1、CCR7-CX3CL1 和CXCR6-CXCL6等[19]，它們之間的相互作用都具有潛在的MSC歸巢趨化能力，但可能存在組織特異性或者相互影響。(2)阻斷MSC的部分歸巢后并未影響MSC修復(fù)受損腎臟的能力，與既往研究一致[20-21]，說明MSC修復(fù)受損腎臟主要是來自于旁分泌的機(jī)制[8]。(3)本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用MSC治療后4周觀察治療效果，如果延長(zhǎng)觀察時(shí)間，用或不用抗CD44抗體提前孵育MSC可能會(huì)因歸巢的數(shù)量差別而表現(xiàn)出不同的治療效果。

綜上所述，在大鼠腎衰竭模型中，MSC表面的受體CD44與受損腎臟組織大量表達(dá)的HA之間的相互作用是影響外源性MSC歸巢于受損腎臟組織的原因之一，但是在觀察期內(nèi)并未影響MSC修復(fù)受損腎臟的能力。

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