三氧化二砷聯(lián)合熱療對(duì)食管癌細(xì)胞株EC-1放療的增敏作用研究

谷見法，馮沛貝，路 平

食管癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤，主要的治療手段是手術(shù)和放療。近年來，食管癌的放療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步[1]，單純放療的療效已與手術(shù)效果相當(dāng)。但有研究顯示，食管癌患者單純放療后生存期很少能超過3年[2]。這是由于食管癌細(xì)胞的放射線抗拒性，同時(shí)放療無法控制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而使局部未控制，導(dǎo)致治療失敗。又因食管周圍毗鄰有心、肺和脊髓等重要臟器，增大照射劑量可使局控率提高，但劑量過大會(huì)對(duì)患者的這些重要器官造成傷害；同時(shí)也存在著諸如遠(yuǎn)期療效并不提高、毒性反應(yīng)較大影響生存質(zhì)量等問題。因此，尋找有效的放療增敏療法及增敏劑，提高食管癌的放射敏感性及局控率，同時(shí)盡量減少對(duì)正常組織的損傷[3]，成為放療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。本研究旨在探討三氧化二砷(As2O3)聯(lián)合熱療對(duì)食管癌放療的增敏作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和試劑 人食管癌細(xì)胞株EC-1由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院腫瘤反轉(zhuǎn)錄分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，用含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%(V/V)胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng)。每24 h更換培養(yǎng)液。每48 h傳代1次。As2O3(10 mg/瓶)購(gòu)自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司。

1.1.2 主要儀器 恒溫循環(huán)水浴器(HX-1050)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；電熱恒溫水浴箱(HB3V21，Cu600)(上海醫(yī)療器械七廠)；恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(英國(guó)RSBionch公司)；倒置顯微鏡(EE 2000-U)(日本Nikon公司)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，6 MV電子直線加速器(德國(guó)西門子公司)，Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司) ；顯微鏡(日本Olympus公司)；OLYMPUS直立光照照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞放射敏感性 實(shí)驗(yàn)分組：?jiǎn)渭兎暖熃M(R組)、熱療+放療組(HR組)、As2O3+放療組(AR組)、As2O3+熱療+放療組(AHR組)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組又接受0、1、2、4、6、8、10 Gy 7種不同劑量的照射。放療均在室溫下照射，電子直線加速器6 MV X線，劑量率為2 Gy/min，照射面積為23 cm×16 cm，源軸距100 cm，培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿下置1.5 cm組織補(bǔ)償膜，機(jī)架角180°，室溫下照射。熱療是將恒溫孵育箱溫度調(diào)至43 ℃穩(wěn)定1晝夜，次日將細(xì)胞培養(yǎng)皿瓶口密封后放入恒溫孵育箱中，加熱30 min，熱平衡5 min。加As2O3，藥物濃度根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)確定半抑制濃度(IC50)，20%IC50為3 μmol/L，作為本實(shí)驗(yàn)藥物濃度，作用時(shí)間為48 h。具體方法如下。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)的EC-1，用胰液常規(guī)消化，并吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并按梯度稀釋分別接種于60 mm培養(yǎng)皿中，并使細(xì)胞在培養(yǎng)皿中均勻分散。將接種好細(xì)胞的60 mm培養(yǎng)皿移入37.5 ℃、5%CO2及99%飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加入As2O3，繼續(xù)放入孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h。然后將各組細(xì)胞培養(yǎng)皿正置，分別給予不同劑量的照射，照射時(shí)培養(yǎng)皿周以封口膜封口，照射后行熱療處理，繼續(xù)在37 ℃、5%CO2及99%飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)24 h，然后棄去含藥物的培養(yǎng)液，換新鮮的不含藥物的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d。細(xì)胞均定期更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)14 d后取出60 mm培養(yǎng)皿，棄培養(yǎng)液，PBS緩沖液清滌兩遍，用5 ml甲醇固定15 min。棄固定液，加用Gimsa液染色20 min，流水緩慢洗去染色液后在空氣中干燥，將60 mm培養(yǎng)皿平放置在一張帶網(wǎng)格的透明膠片，計(jì)數(shù)顯微鏡下>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行培養(yǎng)皿，重復(fù)3次，取平均值。計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)，SF=實(shí)驗(yàn)組每孔克隆數(shù)/(每孔細(xì)胞種植數(shù)×貼壁率)×100%。在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)上以橫坐標(biāo)表示放射劑量，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞SF的對(duì)數(shù)值，根據(jù)擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算出各組平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq,表示細(xì)胞對(duì)亞致死損傷的修復(fù)能力)、平均致死劑量增敏比(SERD0)、準(zhǔn)閾劑量增敏比(SERDq)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率。

1.2.2.1 細(xì)胞周期 取指數(shù)生長(zhǎng)期的EC-1，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/ml，接種在6孔培養(yǎng)板上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每板3 ml。接種后24 h予以下處理：AR組和AHR組給予3 μmol/L的As2O3，HR組和AHR組熱療予以43 ℃加熱30 min，加藥及熱療后24 h行放療，劑量率為2 Gy/min，照射劑量為2 Gy。處理結(jié)束后于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)48 h，消化離心制成單細(xì)胞懸液，以冷PBS洗滌2次。1 ml PBS打散離心管中的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，加入5 μl核糖核酸酶(RNase，10 mg/ml)，置37 ℃水浴中消化1 h以去掉RNA，然后馬上放在冰浴中終止消化。加入50 μl碘化丙啶(PI，1 mg/ml)，避光染色30 min(4 ℃)，400目篩網(wǎng)濾過后，樣品上流式細(xì)胞儀于488 nm處檢測(cè)細(xì)胞DNA含量。每份標(biāo)本累計(jì)分析104個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用Exppo 32 ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，用Multicycle AV分析軟件對(duì)DNA細(xì)胞周期擬合分析。

1.2.2.2 細(xì)胞凋亡率 實(shí)驗(yàn)分組與處理同1.2.2.1，收集各組的EC-1，PBS緩沖液洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，加入1 ml PI染液，用Single histogram statistic軟件分析細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞放射敏感性 各組食管癌細(xì)胞照射后所形成細(xì)胞克隆狀態(tài)見圖1，通過單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線(見圖2)，根據(jù)擬合的細(xì)胞存活曲線以及相關(guān)公式，得出放射學(xué)相關(guān)指標(biāo)(見表1)?？梢奌R組、AR組、AHR組細(xì)胞SF相對(duì)于R組下降，D0、Dq值降低，存活曲線肩區(qū)變窄，SERD0分別為1.059、1.286和1.723，SERDq分別為1.917、3.474和11.000。

2.2 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率 經(jīng)不同處理48 h后各組食管癌細(xì)胞株EC-1所占細(xì)胞周期比例見表2及圖3，其中HR組、AR組及AHR組G0/G1期、S期細(xì)胞比例較R組降低，G2/M期細(xì)胞比例較R組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AR組G0/G1期細(xì)胞比例較HR組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AHR組各細(xì)胞周期細(xì)胞比例與HR組、AR組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組食管癌細(xì)胞株EC-1照射后存活曲線的主要指標(biāo)

注：D0=平均致死劑量，Dq=準(zhǔn)閾劑量，N=靶點(diǎn)數(shù)，SERD0=平均致死劑量增敏比，SERDq=準(zhǔn)閾劑量增敏比；-為無

經(jīng)不同處理48 h后各組細(xì)胞凋亡率見表2，其中HR組、AR組及AHR組細(xì)胞凋亡率較R組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AHR組細(xì)胞凋亡率亦高于HR組、AR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

Table 2 Comparison of cell cycles and cell apoptosis rate in each group

注：與R組比較，*P<0.05；與HR組比較，△P<0.05；與AR組比較，☆P<0.05

圖1 不同處理組食管癌細(xì)胞株EC-1克隆形成情況

注：R組、HR組、AR組、AHR組平均G2/M期細(xì)胞比例分別為17.1%、27.7%、34.1%和58.7%

圖3 各組食管癌細(xì)胞株EC-1的細(xì)胞周期

Figure3 The cell cycle status in different groups

圖2 各組食管癌細(xì)胞株EC-1存活曲線

3 討論

As2O3是中藥砒霜的主要組分，其用于治療疾病已有很長(zhǎng)的歷史，但因?yàn)槠涠拘源螅⒂兄禄?、致突變及致癌作用，限制了其在臨床上的廣泛使用。20世紀(jì)70年代，國(guó)內(nèi)學(xué)者開始將主要成分為As2O3的癌靈1號(hào)應(yīng)用在急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)的治療中，療效顯著[4]。隨后國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始進(jìn)行實(shí)體瘤的基礎(chǔ)與臨床研究，逐漸證實(shí)As2O3對(duì)口腔癌[5]、肺癌[6]、纖維肉瘤[7]、惡性膠質(zhì)瘤[8]、肝癌[9-10]等實(shí)體瘤的放療增敏作用。在食管癌放療增敏方面，景紹武等[11]發(fā)現(xiàn)As2O3能增加放療對(duì)食管癌細(xì)胞株Eca109增殖的抑制作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)As2O3能影響Eca109細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以此來增強(qiáng)放射線對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。

熱療是通過加熱使腫瘤組織的溫度達(dá)到40～44 ℃，從而引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯或死亡的一種治療方式。許多研究證實(shí)，熱療能對(duì)腦膠質(zhì)瘤[12]、宮頸癌[13]、鼻咽癌[14]、肺癌[15]的放療增敏[16]。我國(guó)在20世紀(jì)80年代開始將熱療應(yīng)用于食管癌的治療。郭可鋒等[17]在中晚期食管癌研究中發(fā)現(xiàn)熱療聯(lián)合放療的近期療效(95.8%)明顯優(yōu)于單純放療(70.8%)。其他研究也發(fā)現(xiàn)熱療聯(lián)合放療治療食管癌的療效明顯優(yōu)于單純放療[18-19]。故本研究旨在探討As2O3聯(lián)合熱療對(duì)食管癌放療的增敏作用。

3.1 As2O3、熱療對(duì)放療的增敏效果分析 本研究根據(jù)單擊多靶模型公式進(jìn)行4組人食管癌細(xì)胞株EC-1放射-生存曲線的擬合比較后發(fā)現(xiàn)，ARH組經(jīng)過As2O3、熱療作用后的細(xì)胞D0、Dq、N均減小，提示As2O3能對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC-1放療增敏(SERD0=1.286，SERDq=3.474)，熱療也能對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC-1放療增敏(SERD0=1.059，SERDq=1.917)，而As2O3聯(lián)合熱療后能進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC-1放療增敏作用(SERD0=1.723，SERDq=11.000)。提示經(jīng)As2O3、熱療單獨(dú)作用后，人食管癌細(xì)胞株EC-1對(duì)放療的D0較單純放療降低，肩區(qū)縮小，細(xì)胞亞致死性損傷修復(fù)能力減弱；兩者聯(lián)合作用后對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC-1放療增敏作用明顯增加，對(duì)放療的D0進(jìn)一步降低，肩區(qū)更顯著縮小，細(xì)胞亞致死性損傷修復(fù)能力進(jìn)一步減弱。

3.2 As2O3、熱療的放療增敏機(jī)制探討 目前提高腫瘤放療敏感性的方法主要有：(1)增加對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA損傷或延緩、阻滯損傷的DNA修復(fù)；(2)將細(xì)胞主要阻滯于G2/M期，從而改變細(xì)胞周期分布；(3)使癌基因失活或抑癌基因復(fù)活等[20]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)As2O3、熱療放療增敏機(jī)制進(jìn)行了研究。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示：HR組、AR組細(xì)胞G0/G1期、S期比例較R組降低，G2/M期比例較R組升高，說明無論是熱療還是As2O3，均能促使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，G0/G1期比例降低，與李嵐等[21]在胃癌BGC-823細(xì)胞中研究結(jié)果一致。但也有研究報(bào)道，As2O3作用于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞后細(xì)胞周期阻滯在G2/M期及G1期，這可能與細(xì)胞系不同有關(guān)[22]。As2O3聯(lián)合熱療使對(duì)放射敏感的G2/M期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高(58.7%)，對(duì)放射不敏感的S期細(xì)胞比例進(jìn)一步減少，但降幅不大，最低才降至26.2%。可能原因是As2O3、熱療聯(lián)合放療后，細(xì)胞周期抑制基因p57表達(dá)顯著上調(diào)，而細(xì)胞周期促進(jìn)基因cyclinB的表達(dá)受到明顯下調(diào)所致[22]。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)As2O3、熱療均可增加放射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，而兩者聯(lián)合后使放射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加明顯，但細(xì)胞凋亡率最高才達(dá)3.72%，遠(yuǎn)低于劉敩等[23]用3 μg/ml的As2O3聯(lián)合熱療作用于肝癌24 h的細(xì)胞凋亡率18.6%。此外，在做細(xì)胞周期分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，As2O3、熱療聯(lián)合放療后G0/G1期細(xì)胞比例降至最低，平均為15.1%。細(xì)胞受到DNA損傷后，p53的激活常會(huì)導(dǎo)致G0/G1期停滯，但食管癌細(xì)胞株EC-1可能p53基因突變，G0/G1期不受阻滯，甚至促進(jìn)該期，從而使G0/G1期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞凋亡不明顯，而缺乏p53時(shí)則多引起G2/M期停滯。

總之，As2O3、熱療在治療惡性腫瘤中均具有較大的臨床價(jià)值。實(shí)驗(yàn)及臨床研究提示As2O3、熱療的抗瘤譜較寬，可抑制多種實(shí)體瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡及增加放療敏感性。因此，As2O3、熱療可能為理想的放療增敏劑。本研究提示As2O3、熱療對(duì)食管癌細(xì)胞株EC-1放療有增敏作用，二者聯(lián)合應(yīng)用增敏作用更明顯，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)并做好了鋪墊，但目前對(duì)其作用機(jī)制尚不完全明了，有待進(jìn)一步研究。

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