王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達(dá)日－4味湯對(duì)溫病濕熱模型、炎性反應(yīng)因子IL－1β、IL－6、TNF－α的影響

王雪峰 韓雪梅 任存霞

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)教研室，呼和浩特，010059）

王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達(dá)日－4味湯對(duì)溫病濕熱模型、炎性反應(yīng)因子IL－1β、IL－6、TNF－α的影響

王雪峰 韓雪梅 任存霞

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)教研室，呼和浩特，010059）

目的：通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀(guān)察王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達(dá)日－4味湯對(duì)大鼠濕熱模型、炎性反應(yīng)因子血清白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子α的作用影響。方法：建立大鼠濕熱炎性反應(yīng)模型，設(shè)空白組、模型組、對(duì)照藥組、中藥組、蒙藥組分別采取不同處理方法觀(guān)察記錄各項(xiàng)指標(biāo)，血清細(xì)胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。結(jié)果：中蒙醫(yī)溫病經(jīng)典方在治療大鼠濕熱癥狀上具有可靠療效，尤其在改善大鼠進(jìn)食飲水減少，大便稀軟，口角眼角分泌物增多等方面有顯著成效。ELISA檢測(cè)顯示對(duì)照藥組IL－1β、IL－6、TNF－α無(wú)意義，中藥組TNF－α有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），對(duì)IL－1β、IL－6無(wú)意義（P＞0.05），蒙藥組TNF－α有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）、IL－6有意統(tǒng)計(jì)學(xué)義（P＜0.05），對(duì)IL－1β無(wú)意義（P＞0.05）。結(jié)論：王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達(dá)日－4味湯在解除濕熱癥狀上有切實(shí)可靠的作用，對(duì)腹腔炎性反應(yīng)引起的發(fā)熱及炎性反應(yīng)，雖然細(xì)胞因子血清檢測(cè)沒(méi)有得出有力檢驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，但動(dòng)物模型治療后期各項(xiàng)體征監(jiān)測(cè)都有好轉(zhuǎn)。ELISA檢測(cè)顯示中藥組TNF－α有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；蒙藥組TNF－α有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）、IL－6有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達(dá)日－4味湯；濕熱模型；IL－1β；IL－6；TNF－α

通過(guò)現(xiàn)代科技手段和實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)中蒙醫(yī)溫病學(xué)經(jīng)典有效代表方劑王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達(dá)日－4味湯對(duì)濕熱模型、炎性反應(yīng)因子的影響進(jìn)行研究。在體外抗輪狀病毒、抗腹瀉、抗菌、解熱（溫?zé)崮Ｐ停┑膶?shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，深入開(kāi)展系統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，目的是進(jìn)一步研究對(duì)濕熱模型、炎性反應(yīng)因子白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）、白細(xì)胞介素－6（IL－6）、血清腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的影響。為發(fā)揮中蒙醫(yī)溫病學(xué)有效方劑治療臨床某些病毒感染、細(xì)菌性感染、混合性感染等病癥的“雙抗作用”優(yōu)勢(shì)，擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍提供可靠、科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 動(dòng)物與飼料 Wistar大鼠74只，雌雄各半，體重（180±20）g，清潔級(jí)，購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物許可證：SCXK（蒙）2002－0001。普通固體飼料，購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。高脂飼料：每千克普通飼料粉碎后摻加豬油100 g、蛋黃粉80 g、膽固醇25 g、膽酸鈉2 g［1］，塑形烘干。

1.2 藥物 王氏連樸飲加滑石、黃芩（制厚樸6 g、炒川黃連姜汁9 g、石菖蒲3 g、制半夏3 g、炒香豉9 g、焦山梔9 g、蘆根20 g、滑石9 g、黃芩9 g），以上中藥購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)院，按文獻(xiàn)方法［2］制備濃縮成1 g/mL的水煎液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)制所需濃度；茵達(dá)日－4味湯（連翹40 g、麥冬25 g、拳參35 g、關(guān)木通35 g），購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬中蒙醫(yī)院，為散劑，用時(shí)微煮，制成混懸液備用。柴連口服液，哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：08112114。

1.3 菌株及試劑 大腸埃希氏菌，中國(guó)藥品生物制品鑒定所，菌號(hào)44101。用營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)24 h，傳代2次，接種到平皿培養(yǎng)24 h，生理鹽水洗脫，麥?zhǔn)媳葷嵯♂尀?09/mL濃度。主要試劑；1）IL－1、IL－6、TNF－α用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，北京高博興業(yè)科技有限公司；2）氯化鋇，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)；3）硫酸，北京興青紅精細(xì)化學(xué)品科技有限公司生產(chǎn)；4）蛋黃粉、膽酸鈉、膽固醇（鄭州天健食品科技有限公司）。

1.4 主要儀器 清凈工作臺(tái)SW－CJ－2FD（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），生化培養(yǎng)箱SPX－150（上海申賢恒溫設(shè)備廠(chǎng)），4℃實(shí)驗(yàn)室冰箱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司），電子天平，高壓蒸汽滅菌鍋，高速離心機(jī)，電子體溫計(jì)，多用溫濕度計(jì)，空氣加濕器，酶標(biāo)儀；造模溫箱自制（木箱結(jié)構(gòu)，箱子側(cè)壁頂蓋分別留孔換氣）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 分組 雌雄分籠飼養(yǎng)，大鼠稱(chēng)重，適應(yīng)性飼養(yǎng)期間淘汰一只不合格雄鼠。隨機(jī)分為5組，空白組13只、對(duì)照藥組14只、中藥組14只、蒙藥組14只、模型組18只。自然環(huán)境，正常飲食，自由攝食進(jìn)水適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，每天定期清潔。

1.5.2 造模 空白組：自然環(huán)境正常飲食飼養(yǎng)；模型組：自然環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后放入造模溫箱用高脂飼料喂養(yǎng)。溫箱相對(duì)濕度85%，溫度33℃，每天造模時(shí)間16 h，在大鼠出現(xiàn)濕熱癥狀后大腸桿菌109/（m L·200 g）腹腔注射［3－4］，繼續(xù)放入溫箱造模觀(guān)察3 d；中藥組：過(guò)程同模型組，注射大腸桿菌后灌服王氏連樸飲加黃芩、滑石方2 g/（mL·200 g），分2次灌服，早晚各1次；蒙藥組：過(guò)程同中藥組治療藥物換成茵達(dá)日－4味湯；對(duì)照藥組：過(guò)程同中藥組治療藥物換成柴連口服液治療。

1.5.3 觀(guān)察指標(biāo)及檢測(cè)方法 觀(guān)察濕熱模型的各項(xiàng)體征（體溫、倦怠嗜臥與否、反應(yīng)力、活動(dòng)力、活動(dòng)量、毛發(fā)、飲食飲水、排便次數(shù)、形狀；眼神、口角與眼角出現(xiàn)分泌物、陰部紅腫、等體征現(xiàn)象）體溫測(cè)量在電子體溫計(jì)頂端涂少許液體石蠟，輕緩送入大鼠肛門(mén)20 cm左右，其他體征1次記錄。檢測(cè)目標(biāo)為T(mén)NF－α、IL－1β、IL－6，各組都在濕熱模型組感染大腸桿菌后第3天處死并心臟取血5 mL，4℃3 000 r/min離心10 min，取上清液，4℃保存，待測(cè)。各細(xì)胞因子測(cè)定嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 觀(guān)察濕熱模型的各項(xiàng)體征 大鼠在造模開(kāi)始12 d左右陸續(xù)出現(xiàn)倦怠嗜臥，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)力下降，活動(dòng)量減少，毛發(fā)暗淡枯槁，飲食飲水減少，排便次數(shù)增多且大便稀軟，眼無(wú)光彩、無(wú)神，口角與眼角出現(xiàn)分泌物，陰部紅腫等體征現(xiàn)象，表明出現(xiàn)濕熱癥狀。溫箱造模兩周（出現(xiàn)濕熱癥狀后第3天）進(jìn)行腹腔注射大腸桿菌，后開(kāi)始藥物處理、體溫監(jiān)測(cè)、特征記錄，每次體溫測(cè)量間隔4～6 h，中間隨時(shí)觀(guān)察各項(xiàng)體征，直至治療結(jié)束。在腹腔感染后6～30 h上述濕熱癥狀和炎性反應(yīng)表現(xiàn)發(fā)展迅速并達(dá)到最為嚴(yán)重程度［5］，表明造模成功。在19～35時(shí)段雌性模型組與蒙藥組各出現(xiàn)2例死亡大鼠。此段時(shí)間大鼠聚堆靜臥基本無(wú)活動(dòng)，飲食飲水基本為零，毛發(fā)枯槁蓬松不潔凈，口角與眼角分泌物不能自潔，肛門(mén)括約肌松弛，大便基本不成形，大小便有殘留。治療感染30 h后各項(xiàng)觀(guān)察體征開(kāi)始好轉(zhuǎn)，治療中后期活動(dòng)量增加，飲食飲水明顯好轉(zhuǎn)增多后期基本恢復(fù)正常進(jìn)食飲水，大便基本恢復(fù)正常略為稀軟，眼角口角無(wú)明顯分泌物且有自潔能力，毛發(fā)沒(méi)恢復(fù)光澤，肛門(mén)括約肌基本恢復(fù)正常，陰部紅腫減輕。

2.2 炎性因子IL－1β、IL－6、TNF－α的檢測(cè)及SPSS統(tǒng)計(jì) 正式試驗(yàn)73只大鼠，實(shí)驗(yàn)造模過(guò)程中沒(méi)有大鼠死亡，注射大腸桿菌開(kāi)始藥物治療后蒙藥組死2只、模型組死亡2只皆為雌性，雄性對(duì)照組死亡一只（麻醉取血時(shí)被同籠未麻醉大鼠啃食），最終取得全血標(biāo)本68份進(jìn)行血清ELISA檢測(cè)。

表1 各組大鼠平均體溫

圖1 大鼠平均體溫走勢(shì)圖

表2 血清檢測(cè)各組與空白組比較

由血清檢測(cè)表可看出，模型組與空白組P值均＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為模型組與空白組有差異，其中TNF－α組P值＜0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，造模成功中藥治療組對(duì)溫病發(fā)熱炎性反應(yīng)模型血清TNF－α檢測(cè)P值＜0.01，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)IL－1β、IL－6檢測(cè)皆P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蒙藥治療組對(duì)溫病發(fā)熱炎性反應(yīng)模型血清TNF－α、IL－6比較可看出P＜0.01、P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)IL－1β，P＞0.05不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照藥治療組對(duì)IL－1β、IL－6、TNF－α血清因子影響P值都大于0.05不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)論

1）王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達(dá)日－4味湯在解除濕熱癥狀上有切實(shí)可靠的作用。2）中藥治療組對(duì)溫病發(fā)熱炎性反應(yīng)模型血清TNF－α檢測(cè)P值＜0.01，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)IL－1β、IL－6檢測(cè)皆P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蒙藥治療組對(duì)溫病發(fā)熱炎性反應(yīng)模型血清TNF－α、IL－6比較可看出P＜0.01、P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)IL－1β，P＞0.05不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

在臨床中發(fā)熱、炎性反應(yīng)可由很多種原因引起，是一種很常見(jiàn)的癥狀，疾病的發(fā)展過(guò)程中細(xì)菌感染引起的發(fā)熱最為常見(jiàn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為發(fā)熱的機(jī)制可以大致概括為，外源性致熱原進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性致熱原作用于體溫調(diào)節(jié)中樞使體溫調(diào)節(jié)中樞功能障礙，體溫調(diào)定點(diǎn)上移而引起體溫升高。與發(fā)熱有關(guān)的細(xì)胞因子主要有白介素－1家族及IL－1受體拮抗蛋白、腫瘤壞死因子－α、白介素－6［6］、干擾素［7］，其中IL－1尤其是IL－1β是參與多種致熱原性發(fā)熱的重要細(xì)胞因子［8］，TNF－α是介導(dǎo)炎性反應(yīng)反應(yīng)的主要細(xì)胞因子是重要的內(nèi)生性致熱原，也是一個(gè)比較重要的前炎性反應(yīng)因子及抗腫瘤因子［9］。TNF－α能進(jìn)一步誘導(dǎo)IL－6等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些促炎性細(xì)胞因子參與體內(nèi)急性反應(yīng)、發(fā)熱反應(yīng)、引起趨化膚釋放等，還可使內(nèi)皮細(xì)胞活化而導(dǎo)致血管通透性增加［10］。

王氏連樸飲出自《霍亂論》，由著名醫(yī)家王士雄創(chuàng)制。由制厚樸、黃連、石菖蒲、制半夏、香豉、焦山梔、蘆根組成，后世溫病學(xué)家在本方基礎(chǔ)上加滑石、黃芩，沿用至今。本方具有辛開(kāi)苦降，清熱化濕的功效，是治療濕熱性疾病的代表方，最初為治療濕熱霍亂主方，目前臨床治療濕熱中阻等病證，以發(fā)熱汗出不解，心中煩悶，脘痞腹脹，嘔吐腹瀉，便溏色黃，口渴不欲多飲，尿赤澀，舌紅，苔黃膩，脈滑數(shù)等癥狀為主。蒙醫(yī)溫病學(xué)方劑茵達(dá)日－4味湯又名音達(dá)日－西湯，是蒙藥臨床的傳統(tǒng)方劑，茵達(dá)日－4味湯在蒙藥經(jīng)典古籍《四部醫(yī)典》中有明確記載，由連翹、麥冬、拳參、木通組成，具有清熱、解毒、止瀉的功效，主治腸熱痢疾、腹痛、腹瀉等病證，用于小腸熱證，是蒙醫(yī)臨床治療熱瀉的經(jīng)典方劑。

大鼠濕熱模型并炎性反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究表明中蒙醫(yī)溫病經(jīng)典方在治療大鼠濕熱癥狀上具有明顯效果，尤其在改善因濕熱導(dǎo)致大鼠進(jìn)食飲水減少，大便稀軟，口角眼角分泌物增多方面在經(jīng)過(guò)2 d治療后已有明顯成效。在治療的第2天大鼠因濕熱引起的諸多癥狀都有不同程度緩解改善［11］，因濕熱性疾病屬臨床難治性、頑固性疾病，中蒙醫(yī)溫病經(jīng)典方王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達(dá)日－4味湯對(duì)濕熱模型的癥狀的顯著改善，再一次驗(yàn)證了中蒙醫(yī)藥治療濕熱的綜合生物效應(yīng)，即多靶點(diǎn)、多途徑、多作用的結(jié)果。溫病濕熱模型的濕與熱偏重不同［12］也影響著TNF－α、IL－6、IL－1β的含量［13］。有報(bào)道表明在輪狀病毒感染時(shí)宿主發(fā)生特異性和非特異性免疫反應(yīng)，而IL－6、IL－1β以及TNF－α是感染早期非特異性及隨后發(fā)生的抗原特異性免疫間的功能性橋梁，在不同時(shí)期其含量也不同［14］。實(shí)驗(yàn)藥物的劑量對(duì)中醫(yī)藥治療疾病也有重要影響［15］。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以認(rèn)定王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達(dá)日－4味湯在解除濕熱癥狀上有切實(shí)可靠的作用。對(duì)腹腔炎性反應(yīng)引起的發(fā)熱及炎性反應(yīng)，在動(dòng)物模型治療后期各項(xiàng)體征監(jiān)測(cè)都有好轉(zhuǎn)。中藥治療組對(duì)溫病發(fā)熱炎性反應(yīng)模型血清TNF－α檢測(cè)P值＜0.01，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，蒙藥治療組對(duì)溫病發(fā)熱炎性反應(yīng)模型血清TNF－α、IL－6比較可看出P＜0.01、P＜0.05，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果進(jìn)一步揭示了王氏連樸飲加滑石、黃芩；劑茵達(dá)日－4味湯在抗炎中分子生物學(xué)的作用機(jī)制。中藥治療組對(duì)溫病發(fā)熱炎性反應(yīng)模型血清IL－1β、IL－6檢測(cè)P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；蒙藥治療組對(duì)溫病發(fā)熱炎性反應(yīng)模型血清IL－1β，P＞0.05不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)這可能與IL－1β、IL－6、TNF－α在機(jī)體中作用時(shí)間、在血清中存在時(shí)段不同有關(guān)，或藥物達(dá)到預(yù)定效果治療時(shí)間不夠等有關(guān)。

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（2014－05－27收稿 責(zé)任編輯：徐穎）

Wangshilianpu Drink Plus Talcum，Baical Skullcap Root and Yindari-4 Decoction Treating Animal Model of W arm Disease w ith Dam p-heat Syndrome and Its Effects on the Inflammation Factors of IL-1β，IL-6 and TNF-α

Wang Xuefeng，Han Xuemei，Ren Cunxia
（Department of Traditional Chinese Medicine，Inner Mongolia Medical University，Hohot010059，China）

Objective：To observeWangshilianpu drink plus talcum，baical skullcap rootand Yindari-4 decoction treating ratmodelswith damp-heat syndrome，and its effect on inflammatory factors of Factors of IL-1β，IL-6 and TNF-α.Methods：Damp heat inflammation of ratsmodelwas set up，and there were four groups of rats including the blank group，model group，control group，the Chinese medicine group，and Mongolianmedicine group.Different treatmentswere conducted and index，serum cytokines beta，IL-6，IL-1 TNF alpha test were observed by using enzyme-linked immunosorbent（ELISA）.Results：The classic prescriptions of Chinese and Mongolian medicine treating warm diseases had reliable efficacy in the treatment of ratswith damp-heat symptoms，especially in improving the reduced intake ofwater，runny stool and spatcanthus secretion.ELISA detection showed that therewas no significant improvement in the controlgroup in terms of IL-1β，IL-6 and TNF-αbeta；Chinese traditionalmedicine group showed obvious difference in terms of TNF-α（P＜0.01），and there was no significant improvement on IL-1 beta and IL-6（P＞0.05）；the Mongolian group showed significant improvement on IL-6（P＜0.05）and TNF-αv（P＜0.01），and no significantdifference on IL-1βv（P＞0.05）.Conclusion：Wanglianpu drink plus talcum，baical skullcap rootand Yindari-4 decoction on relieving symptoms of damp-heat syndrome ispractical and reliable.As for fever and inflammation caused by abdominal inflammation，although cytokines serum does not draw strong inspection data support，but the animalmodels have better physical signs in the late phase of treatment.ELISA detection shows that Chinese traditional medicine group has obvious difference in TNF alpha（P＜0.01），and the Mongolianmedicine group has obvious improvement in TNF alpha（P＜0.01）and significant improvement in IL-6（P＜0.05）.

Wanglianpu drink plus talcum，Baical skullcap root and Yindari-4 decoction；Damp-heat syndrome；IL-1β；IL-6；TNF-α

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673－7202.2014.11.033

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2010Zd34）

王雪峰（1987—），男，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)2012級(jí)在讀研究生

韓雪梅（1956—），女，本科，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)溫病方藥的臨床應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)研究，E－mail：hanxuemeihaohao＠sina. com