腎茶對UUO大鼠腎組織FaS、FasL表達(dá)的影響

王麗敏，田玉鳳，譚振香，郭佳麗，Amrita Shrestha(尼泊爾)，王 超

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，黑龍江 佳木斯 154003)

腎茶作為傳統(tǒng)民間藥物已流傳使用了幾百年，民間常用來治療急慢性腎炎、泌尿系統(tǒng)結(jié)石、膀胱炎、痛風(fēng)、動脈硬化、黃疸、咽炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。毒性小，使用安全。本實驗旨在研究腎茶對UUO大鼠腎小管上皮細(xì)胞Fas、FasL表達(dá)的影響,揭示腎茶在腎間質(zhì)纖維化形成中保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

72只清潔級SD大鼠，雄性，體重(100±5)g,購自長春實驗動物中心。隨機分為假手術(shù)組、模型組、腎茶組3組,每組24只，模型組、腎茶組分別行左側(cè)輸尿管結(jié)扎、離斷,假手術(shù)組只將左側(cè)輸尿管分離,不結(jié)扎、離斷。腎茶組給予劑量為8g/kg的腎茶煎劑灌胃，模型組、假手術(shù)組則給予等體積0.9%生理鹽水代替灌胃。

1.2 建立UUO模型

按照董飛俠，何立群等人報道的方法進(jìn)行[1]。采用10%水合氯醛(0.35mL/100g計算)將大鼠麻醉,待麻醉起效后將大鼠固定為左側(cè)俯臥位, 在其左側(cè)肋脊角下方約0.5cm的皮膚處縱行切開,將其皮下組織及肌層鈍性分離,暴露左側(cè)腎臟,分離其左輸尿管,并于中上1/3處結(jié)扎,離斷，使左腎梗阻,逐層縫合完畢后，背部皮下注射5萬U青霉素鈉。假手術(shù)組大鼠暴露左腎后只分離輸尿管,不結(jié)扎。

1.3 實驗方法

購置大鼠后,放置在清潔級飼養(yǎng)房并適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,造模成功后, 分別于術(shù)后3d、7d、14d各組分別隨機選取8只大鼠，麻醉后心臟取血，用來測定血尿素氮、血肌酐，處死大鼠并摘取其左側(cè)腎臟,左腎組織采用免疫組化法檢測蛋白Fas和FasL。

1.4 試劑及檢測

免疫組化試劑盒購自天津所羅門生物制品公司，其中一抗Fas、FasL為兔抗大鼠蛋白抗體。經(jīng)DAB顯色后，將含有黃色顆粒的腎實質(zhì)及間質(zhì)細(xì)胞視為陽性,免疫組化的結(jié)果采用多功能彩色計算圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，每例分別隨機選取5個高倍視野,計算每個視野內(nèi)染色區(qū)域的面密度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件，三組均數(shù)間比較用隨機區(qū)組方差分析；兩組均數(shù)間差別用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血肌酐,尿素氮測定

造模后3d,7d,14d模型組及腎茶組大鼠血Scr、BUN升高，與假手術(shù)組相比，各組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);其中模型組上升明顯,同假手術(shù)組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);腎茶組與模型組相比各時間點Scr、BUN下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠各時間點血Scr、BUN的變化

注：*與假手術(shù)組比較P<0.05;▲與模型組比較P<0.05。

2.2 免疫組化法檢測Fas和FasL

2.2.1 Fas及FasL的表達(dá)

Fas、FasL主要表達(dá)于近端腎小管上皮細(xì)胞, 其中皮髓質(zhì)交界處表達(dá)強，而在遠(yuǎn)端腎小管、系膜細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等表達(dá)極少。見圖1。

2.2.2 Fas、FasL 面密度半定量分析

假手術(shù)組大鼠術(shù)側(cè)(左側(cè))腎各時間點Fas、FasL表達(dá)均較弱；同假手術(shù)組相比，模型組自造模后3d后腎小管上皮細(xì)胞Fas、FasL表達(dá)愈發(fā)增強，各時間點差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);同模型組相比，腎茶組造模后各時間點Fas、FasL表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖2 術(shù)后各組大鼠FasL的表達(dá)(10×40)

表2 各組大鼠各時間點Fas、FasL 面密度半定量分析

注：*與假手術(shù)組比較P<0.05;▲與模型組比較P<0.05。

3 討論

各種原因所致慢性腎臟病進(jìn)展的共同途徑是不可逆的腎臟間質(zhì)纖維化，這一不可逆的腎損害最終導(dǎo)致腎高血壓乃至腎衰竭,而腎臟細(xì)胞凋亡在這一病理生理形成的過程中起到了重要的作用[2]。李彪等[3]研究結(jié)果顯示腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展與腎小管上皮細(xì)胞的過度凋亡密切相關(guān),而高表達(dá)的Fas/FasL導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡,這一機制最終使腎小管上皮細(xì)胞數(shù)目減少,臨床表現(xiàn)為腎功能下降，這說明Fas系統(tǒng)介導(dǎo)了腎小管上皮細(xì)胞的凋亡[4]。UUO模型是結(jié)扎單側(cè)輸尿管以造成腎功能損傷、間質(zhì)纖維化、腎小管細(xì)胞凋亡及炎癥細(xì)胞浸潤為特征的經(jīng)典模型,也是目前應(yīng)用最廣泛的腎間質(zhì)纖維化模型[5]，顯著改善UUO模型的腎臟損傷可以通過調(diào)控腎小管細(xì)胞凋亡而實現(xiàn)[6]。 膜FasL、抗Fas-特殊的抗體和塊狀可溶的FasL的刺激可引起誘導(dǎo)的含有Fas蛋白的細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。多種腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及修復(fù)過程與細(xì)胞凋亡有關(guān)，而這一過程受多種因素調(diào)控[8]，在眾多凋亡調(diào)控因素中Fas/FasL最具代表性，因其可直接參與啟動細(xì)胞凋亡[9]。有研究用DNA 斷裂的原位末端標(biāo)記法測得急性腎衰竭時腎小動脈、腎小管及周圍區(qū)域的細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，腎功能的下降與凋亡小體的不斷增加相一致;同時免疫組化結(jié)果顯示，在UUO腎組織的近曲小管遠(yuǎn)曲小管周圍Fas/FasL表達(dá)明顯增加，這一結(jié)果提示Fas/FasL途徑參與了腎小管上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而本研究也有相似的發(fā)現(xiàn)。

本實驗采用經(jīng)典的UUO(腎間質(zhì)纖維化)模型，研究梗阻性腎病時腎茶干預(yù)與否的腎小管上皮細(xì)胞Fas、FasL的表達(dá)的變化，研究結(jié)論提示正常的腎臟組織在各時間點Fas、FasL表達(dá)少量，當(dāng)發(fā)生腎纖維化時其表達(dá)量明顯增強，隨著造模時間的延長Fas、FasL表達(dá)量逐漸增加，這與仙淑麗等人的[10]研究一致。Fas、FasL表達(dá)的這種變化可能因為腎發(fā)生梗阻時，腎固有細(xì)胞凋亡大于細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致增殖與凋亡關(guān)系的失衡，引起臨床上一系列病理生理變化。 腎茶(C.Spicatus)是一種多年生草本植物，唇形科貓須草屬(Clerodendranthus)，又稱貓須草、牙路妙、貓須公,此藥為印度尼西亞草藥，當(dāng)?shù)蒯t(yī)生常用治結(jié)石病，效果頗著。該藥從印尼至南亞諸島及澳洲均有生長，近年來有應(yīng)用單味腎茶及其復(fù)方制劑治療尿路感染,腎病綜合征[11]、腎衰竭[12]等臨床報道。

本研究結(jié)果表明，單味腎茶對UUO大鼠腎功能及腎纖維化的發(fā)展具有保護作用，其機制之一可能是通過調(diào)節(jié)Fas/FasL系統(tǒng)，降低Fas、FasL蛋白的表達(dá)水平，從而抑制腎小管細(xì)胞的凋亡。然而，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)只是凋亡發(fā)生過程中眾多傳導(dǎo)途徑中的其中之一，其抑制凋亡的機制是否還與其他信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)，另外，臨床上腎茶若與西藥結(jié)合治療腎纖維化是否效果更好，均尚待進(jìn)一步探索研究。

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