左乙拉西坦對致癇大鼠海馬組織中BMP4表達的影響

王一川，穆國軍,王 影

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)二科，黑龍江 佳木斯 154003)

癲癇(epilepsy,EP)是一種慢性疾患，是兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的常見病，其特點是大腦神經(jīng)元反復發(fā)作性異常放電，可突然、陣發(fā)、反復發(fā)作的一組臨床綜合征。癲癇的發(fā)病率與年齡有一定的關系，嬰幼兒時期是患病率最高的，反復的癲癇發(fā)作嚴重影響患兒的健康和生活質(zhì)量[1]。有研究表明，早發(fā)性癲癇，可能會導致智力能力和特定的認知功能受損，如意識、運動功能等[2]。目前，國內(nèi)治療癲癇的方法，主要依賴于長期的藥物治療。左乙拉西坦是一種新型抗癲癇藥物，與其他的抗癲癇藥作用機制較復雜，有研究資料表明：癲癇可導致海馬組織中的BMP4表達，但左乙拉西坦對海馬組織中的BMP4表達的影響國內(nèi)外尚無研究報道，本課題將對此進一步探索。

1 材料與方法

1.1 動物分組

將116只Wistar大鼠隨機分為：鹽水組(NS組)24只、左乙拉西坦對照組(LEV對照組)24只、模型組(PILO組)34只、模型組+左乙拉西坦組(LEV治療組)34只。

1.2 主要的實驗試劑

氯化鋰，匹羅卡品 ( Sigma公司 )，左乙拉西坦( UCB S.A.Belgim 公司 ) , RT PCR 試劑盒、引物合成(北京華邁科生物技術有限公司)。

1.3 模型制作

參照相關文獻[3]的模型制作，具體操作步驟如下:按順序測量每只大鼠體重，隨機分組標記并記錄，取PILO組和LEV治療組，先將氯化鋰溶于滅菌注射用水(10mg/mL)，按125mg/kg對大鼠進行腹腔注射,16h后，以1mg/kg的硫酸阿托品對大鼠腹腔注射，拮抗外周膽堿能反應，30min后，腹腔注射匹羅卡品60mg/kg，觀察大鼠的情況，影像學記錄，如果沒有出現(xiàn)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)，應每隔30min重復腹腔注射匹羅卡品1次, 再次應用匹羅卡品劑量減小至15mg/kg，直至出現(xiàn)Ⅲ級以上癲癇持續(xù)發(fā)作,始終不出現(xiàn)Ⅲ級以上癲癇發(fā)作的大鼠不應納入本實驗，但如果大鼠癲癇發(fā)作持續(xù)15min以上，立即予以10%的水合氯醛3mL/kg腹腔注射，以終止癲癇發(fā)作。對NS對照組和LEV對照組，每次對大鼠進行腹腔注射等量生理鹽水。大鼠癲癇發(fā)作的評分標準采用國際Racine分級：即0級:無驚厥發(fā)作;Ⅰ級:耳面部抽搐;Ⅱ級:耳面部抽搐+節(jié)律點頭,但無直立位;Ⅲ級:肌陣攣,伴前肢站立;Ⅳ級:全身強直陣攣發(fā)作;Ⅴ級:全身強直陣攣發(fā)作+失去體位控制。LEV對照組和LEV治療組，將左乙拉西坦片溶解于滅菌注射用水中(10mg/mL)，對大鼠灌胃，劑量為200mg/kg；對NS組、PILO組，予等量生理鹽水進行灌胃，均每天一次，連續(xù)灌胃3周。

1.4 采集標本與測定

組織切片與取材，提取海馬組織。分別于模型制作的第1、2、3周，乙醚罐中放入大鼠，吸入高濃度乙醚達到麻醉狀態(tài)時，斷頭活殺，迅速剪開大鼠的顱骨以取出海馬組織，存入實驗室-70℃冰箱內(nèi)保存，待所有樣本集全，做提取mRNA準備。

1.5 RT-PCR測定BMP4的表達

將海馬組織加入Trizol液提取總mRNA,進行逆轉錄合成cDNA。將cDNA產(chǎn)物進行RT-PCR循環(huán)。設計BMP4和GAPDH實驗引物序列，引物由天津意源達生物試劑有限公司合成，PAGE純化。β-actin為內(nèi)參，β-actin上游引物：5’-CATCCGTAAA GACCTCTATGCCAAC- 3’，下游引物：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA- 3’，擴增長度171bp;BMP4上游引物：5'-TGGACACCTCATCACACGACTA-3，BMP4下游引5'-GCGA- CGGCAGTTCTTATTCTTC-3' ，擴增長度352bp。進行PCR反應后，開始瓊脂糖凝膠電泳。應用凝膠成像軟件測定BMP4的表達。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 記錄觀察各組大鼠行為學變化

PILO模型組和LEV治療組，在匹羅卡品腹腔注射的約5～10min，大鼠就出現(xiàn)癲癇發(fā)作，表現(xiàn)為點頭、洗臉、瞳孔縮小、血淚、豎毛、流涎、排泄、跌倒、前肢陣攣、翻滾以至全面性強直陣攣發(fā)作，均出現(xiàn)Ⅲ級以上癲癇持續(xù)發(fā)作。在大鼠癲癇持續(xù)發(fā)作超過15min后，給予10%的水合氯醛3mL/kg腹腔注射，以終止癲癇發(fā)作。其后，LEV治療組每日一次給予LEV200mg/kg灌胃治療，LEV治療組大鼠比PILO組癲癇發(fā)作及程持續(xù)時間及程度明顯減少。LEV對照組與NS對照組無抽搐發(fā)作。

2.2 各組大鼠海馬組織中BMP4表達

表1所示各組海馬組織中BMP4-mRNA的相對表達量的比較:與NS對照組相比，各時間點的PILO模型組和LEV治療組海馬組織中BMP4-mRNA的表達水平明顯升高,尤以1w升高非常顯著(P<0.01)，以后逐漸降低，但仍高于NS對照組。各時間點LEV治療組與PILO模型組相比較，LEV治療組的BMP4-mRNA表達水平顯著低于PILO模型組(P<0.01)。各時間點LEV組與NS組比較，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1，圖1。

表1 各組大鼠海馬組織中BMP4-mRNA的相對表達量的比較

注：*與NS組比較：P>0.05；★與NS對照組比較：P<0.01；#與NS對照組比較：P<0.01；※與PILO模型組：P<0.01。

圖1 RT-PCR檢測各組大鼠BMP4的表達

3 討論

癲癇是兒童時期常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，在嬰兒及兒童時期發(fā)病率較高,2歲之前發(fā)生率約占癲癇患者總數(shù)的40%[4]。海馬是大腦神經(jīng)發(fā)育的最重要腦區(qū)之一，無論在胚胎時期乃至成年，海馬對于短暫記憶以及學習習慣起著基本的作用[5]。很多學者研究發(fā)現(xiàn)，海馬做為在大腦中發(fā)作閾值低的部位，是幾乎所有癲癇患者發(fā)作的起始區(qū)，而且，以海馬區(qū)為主的癲癇發(fā)作，長期反復發(fā)作，大多很難用藥物控制[6]。研究證實，長期反復的癇性發(fā)作，可使人類神經(jīng)元損傷和神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生[7]。

BMP是一種多功能的生長因子，屬于轉化生長因子(TGF-β)超家族成員。BMP信號通過絲氨酸或蘇氨酸激酶受體調(diào)節(jié)、分化，促進和培養(yǎng)的神經(jīng)元的生長，對調(diào)節(jié)和平衡神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的發(fā)育，發(fā)揮重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，BMP與神經(jīng)元損傷和神經(jīng)膠質(zhì)細胞電位有著密切的關系[9]。其中，BMP 4信號被報道對星形膠質(zhì)細胞系增殖是必不可少的[10]。馬玉新[11]等人通過用戊四氮建立癲癇大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在模型建立的5d后BMP4免疫反應樣陽性細胞顯著增多并達到高峰，以后表達逐漸下降，90d后仍高于正常對照組。有研究發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠海馬有少量BMP4表達。在癲癇發(fā)作的3d后BMP4 mRNA表達明顯增高，達到高峰，此后表達水平逐漸下降[12]。 左乙拉西坦是一種新型的第二代廣譜抗癲癇藥，具有易溶解和生物利用率高的化合物，不良反應少，口服幾乎完全吸收。目前關于左乙拉西坦對BMP4表達尚無研究報道，本實驗研究結果顯示，左乙拉西坦可以抑制癲癇海馬組織中BMP4的表達，從而抑制癲癇發(fā)作。

綜上所述，左乙拉西坦可能是通過抑制海馬組織中BMP4的表達上調(diào)，提高驚厥發(fā)作閾值，抑制星形膠質(zhì)細胞系增殖，從而降低癲癇的敏感性而發(fā)揮其抗癲癇作用。本文的研究為進一步明確海馬組織中BMP4表達上調(diào)及神經(jīng)元可塑性在癲癇形成中發(fā)揮的重要作用提供了理論依據(jù)，更為癲癇的臨床治療提供了新的思路。

[1]Buckmaster PS, Zhang GF, Yamawaki R.Axon sprouting in a model of temporal lobe epilepsy creates a predominantly excitatory feedback circuit[J].J Neurosci，2002，22:6650-6658

[2]Helmstaedter C, Elger CE.Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease[J].Brain，2009，132:2822-30.

[3]楊益，孫紅斌.氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型研究[J].實用醫(yī)學臨床雜志，2008,5(3)：112-114

[4]王海燕,王影,聶磊,等.左乙拉西坦對癲痛大鼠認知功能及海馬組織中NPY和NCAM-mRNA表達的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2013,36(3)：3-5

[5]Tobias Bast, Iain A Wilson, Menno P Witter,et al.From Rapid Place Learning to Behavioral Performance: A Key Role for the Intermediate Hippocampus[J].PLOS Biol，2009，7(4)：1371-1378

[6]Braxton A,Norwood, Argyle V.Bumanglag,Classic hippocampal sclerosis and hippocampal-onset epilepsy produced by a single “cryptic” episode of focal hippocampal excitation in awake rats[J].J Comp Neurol，2010，518(16):3381-3407

[7]Biagini G, Baldelli E, Longo D,et al.Proepileptic influence of a focal vascular lesion affecting entorhinal cortex-CA3 connections after status epilepticus[J].J Neuropathol Exp Neurol，2008，67:687-701

[8]Byoung-San Moon,Ju-Yong Yoon,Mi-Yeon Kim,et al.Bone morphogenetic protein 4 stimulates neuronal differentiation of neuronal stem cells through the ERK pathway[J].Exp Mol Med，2009，41(2):116-125

[9]Qinjie Weng,Ying Chen,Haibo Wang.Dual-mode Modulation of Smad Signaling by Smad-interacting Protein Sip1 is Required for Myelination in the CNS[J].Neuron，2012，73(4):713-728

[10]Hall AK, Miller RH.Emerging roles for bone morphogenetic proteins in central nervous system glial biology[J].J Neurosci Res，2004，76:1-8

[11]馬玉新，楊輝.Noggin和BMP4參與PTZ點燃幼年癲癇大鼠海馬發(fā)育的作用研究[J].第三軍醫(yī)大學博士學論文，2007，5

[12]陰金波，楊輝.BMP4與noggin在大鼠KA顳葉癲癇模型海馬神經(jīng)發(fā)生和癲癇形成中的作用[D].第三軍醫(yī)大學博士學論文，2007，5