溪黃草水提物對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究

葉秋瑩 張黎黎 黃自通 許佳鑫 李元棟 吳泰逸 黃輝 林冰淇 林妙倩

【摘 要】 目的：探究溪黃草水提物的保肝作用。方法：將48只小鼠隨機(jī)分為4組，采用酒精建立急性肝損傷模型，其中溪黃草組和陽(yáng)性組分別灌服溪黃草水提物（6g生藥/kg）、聯(lián)苯雙酯滴丸（200mg/kg），正常對(duì)照組和模型組灌服等體積的生理鹽水，間隔1h后，除了空白組，其余組均灌服 52°乙醇，連續(xù)10d。收集血液和肝臟組織樣本，檢測(cè)天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的含量和丙二醛 （MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性變化。結(jié)果：與空白組比較，模型組肝臟受損，ALT、AST含量升高，顯示造模成功;溪黃草水提物能顯著減少ALD小鼠肝臟、血清的ALT、AST和MDA含量和提高GSH-px、SOD活性。結(jié)論：溪黃草水提物對(duì)小鼠酒精性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，作用機(jī)制與調(diào)整抗氧化酶系統(tǒng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 溪黃草;酒精性肝損傷;氧化應(yīng)激

【中圖分類號(hào)】R932 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）21-0024-05

Abstract：Objective To study the protective effect of extract of Rabdosia serra to alleviate acute liver injury caused by alcohol. Methods Forty eight mice were randomly divided into four groups of 15 mice each. A model of acute liver injury in mice was established with alcohol. The Rabdosia serra group and the positive control group were infused with extract of Xihuangcao （6g crude drug / kg） and bifendate pill （200mg/kg）， respectively.The normal group and the model group were treated with an equal volume of saline.Except for the normal group， the other groups were perfused with 52 ° ethanol after 1 hour，once a day，for consecutive10 days. After medication， blood and liver tissue samples were collected and tested for the contents of ALT，AST in serum，the activities or contents of SOD，GSH-Px，MDA in liver tissue. Results ?Compared with the normal group， the liver of the model group was damaged， and the contents of ALT and AST increased， indicating that the model was successfully created. The extract of Rabdosia serra significantly reduce ALT， AST， and MDA contents and increase GSH-px and SOD activities in liver and serum of ALD mice.Conclusions ?Rabdosia serras extract has obvious protective effect on alcoholic liver injury in mice， and the mechanism is related to adjusting the antioxidant enzyme system.

Keywords：Rabdosia serra; Alcoholic liver disease; Oxidative stress

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平得到顯著改善，我國(guó)酒精類飲料的產(chǎn)量和消耗量隨之迅速增長(zhǎng)，酒精性肝損傷即酒精性肝?。ˋlcoholic Liver Disease，ALD）患者數(shù)量也逐年上升[1-2]。被大量研究證實(shí)具有明確保肝作用的溪黃草Rabdosia serra （Maxim.） Hara，為唇形科香茶菜屬植物，為民間常用的中草藥，具有清熱解毒、退黃祛濕、涼血散瘀、抗感染、抗菌、保肝等作用，臨床用于治療乙型肝炎、急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎等癥[3-6]。然而溪黃草改善酒精性肝損傷機(jī)理研究尚不明確，但近年來的ALD發(fā)病機(jī)理研究焦點(diǎn)主要集中在氧化應(yīng)激及相關(guān)因子上，認(rèn)為氧化應(yīng)激是ALD發(fā)病過程中的重要因素，過程中產(chǎn)生的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）自由基為推動(dòng)ALD發(fā)展的關(guān)鍵成分[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)基于氧化應(yīng)激發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步探討溪黃草水提物對(duì)ALD小鼠的保肝作用機(jī)制。

1 材料

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 溪黃草（Rabdosia serra （Maxim.） Hara）（湖北金貴中藥，批號(hào)：A180301）、聯(lián)苯雙酯滴丸藥品（廣州白云山星群藥業(yè)，批號(hào)：NF40005）購(gòu)于陽(yáng)光大藥房;谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠，SPF級(jí)，雄性，體重18～22g，均于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采購(gòu)，小鼠生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2016-0041。實(shí)驗(yàn)條件溫度保持為20～25℃，相對(duì)濕度在40%～70%，飼養(yǎng)3d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 溪黃草水提液的制備 稱取6g的溪黃草，加100mL水，浸泡1h，加熱煮沸，煮沸開始計(jì)時(shí)1h，稍冷，用四層紗布過濾得中藥水煎液①。重復(fù)上述過程，用四層紗布過濾得中藥水煎液②。合并濾液，濃縮至20mL，得質(zhì)量濃度為 0.6g/mL（以生藥量計(jì)）的藥液，置于 4 ℃冰箱中密封保存[8]。

2.2 動(dòng)物分組造模及給藥 將48只SPF級(jí)健康雄性昆明小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組（酒精：52°白酒）、陽(yáng)性組（藥物：聯(lián)苯雙酯滴丸，200mg/kg）、溪黃草組（6g生藥/kg）4組，每組12只。每日空白組、模型組小鼠按0.1mL/10g給予蒸餾水，陽(yáng)性組、溪黃草組小鼠按0.1mL/10g灌胃給藥，1次/d，共10d。每次給藥后1h，除空白組外的其余各組小鼠按0.1mL/10g灌胃給予52°白酒造模，1次/d，共10d。

2.3 樣本的采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束末（實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水），小鼠眼球取血，離心分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?，之后頸椎脫臼處死小鼠，立即摘取肝臟，用預(yù)先冰浴滅菌的生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱取肝臟濕重，攤開進(jìn)行拍照。取剩余部位組織若干塊，分別置10mL EP管中，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 指標(biāo)觀察及測(cè)定方法

2.4.1 動(dòng)物的日常情況 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠的行為活動(dòng)、攝食、毛發(fā)、飲水及精神狀態(tài)等情況，做好觀察記錄。

2.4.2 肝臟形態(tài)及肝臟指數(shù)的計(jì)算 脫臼處死并解剖小鼠后，肉眼觀察并分析小鼠肝臟的病變情況（包括色澤、形態(tài)等）。

肝臟指數(shù)（%）=肝臟濕重（g）體質(zhì)量（g）×100%

2.4.3 生化指標(biāo)的檢測(cè) 取出存于-20℃的小鼠血清，梯度解凍，用試劑盒測(cè)試。按照試劑盒操作方法測(cè)定血清和肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase， ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase， AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性及丙二醛 （MDA）的含量。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以Graphpad prism 5.0作圖。數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01 表示差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 溪黃草水提液對(duì)小鼠體重、肝臟重量、肝臟指數(shù)及一般情況的影響 實(shí)驗(yàn)期間對(duì)小鼠進(jìn)行一般體征觀察，空白組小鼠在攝食與飲水方面正常，毛色光亮，活動(dòng)正常，其余各組均出現(xiàn)攝食與飲水量略有減少的現(xiàn)象，其中模型組小鼠毛色不光澤，行動(dòng)略遲緩。除了空白組，給予其余各組小鼠52°白酒后，均出現(xiàn)不同程度的醉酒現(xiàn)象：反應(yīng)遲鈍、流涎、四肢癱軟、步履不穩(wěn)、嗜睡等，有部分小鼠出現(xiàn)前爪撓嘴的現(xiàn)象，甚至伴隨呼吸急促。在給予藥物后，陽(yáng)性對(duì)照組和溪黃草組可逐漸恢復(fù)正常。

與空白組小鼠相比，各組小鼠體重顯著下降（P<0.05），其中溪黃草組下降最為顯著（P<0.01）;模型組的肝臟重量略有增加，通過肝臟系數(shù)計(jì)算公式得出的，其肝臟指數(shù)顯著增加（P<0.05），表明酒精造成的肝損傷會(huì)使得肝細(xì)胞腫大;與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照和溪黃草組均顯著降低（P<0.05），說明兩者藥物均可以緩解小鼠肝臟受損情況。結(jié)果見表1。

3.2 肝臟形態(tài)的肉眼觀察 空白組的小鼠肝臟形態(tài)正常，肝色鮮紅，包膜光滑，濕潤(rùn)，有彈性，且邊緣銳利（小框所示）、質(zhì)韌，無病變現(xiàn)象;模型組的肝臟外觀主要表現(xiàn)為灰黃色點(diǎn)狀壞死灶，肝色暗沉，包膜略光滑，邊緣變鈍（小框所示），質(zhì)地變軟，易碎，切面略帶油膩感，說明酒精所致小鼠急性肝損傷造摸成功;與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和溪黃草組的病變現(xiàn)像有所改善，肝色偏鮮紅，略濕潤(rùn)，彈性增加，邊緣組織鈍化不明顯（小框所示），而且兩組間外觀觀察，無明顯的區(qū)別，說明溪黃草對(duì)急性酒精性肝損傷有一定的改善作用。結(jié)果如圖2所示。

3.3 溪黃草水提取物對(duì)肝臟、血清中肝功能指標(biāo)的影響 與空白對(duì)照組比較，急性酒精性肝損傷小鼠肝臟、血清ALT、AST含量均顯著增加，提示造模成功;與模型組比較，陽(yáng)性組和溪黃草組的ALT、AST含量顯著降低（P<0.01），提示溪黃草水提物能改善急性肝損傷的肝功能指標(biāo)水平。結(jié)果見表 2、3。

3.4 溪黃草水提物對(duì)ALD小鼠的抗氧化水平的影響 酒精會(huì)在人體的新陳代謝中產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），影響機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致酒精性肝損傷，而體內(nèi)的抗氧化劑會(huì)保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的影響，但這些抗氧化劑的活性很容易被過量的脂質(zhì)過氧化物清除，導(dǎo)致肝臟損傷[9]。與空白組相比，模型組小鼠肝臟、血清中的谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）和超氧化物歧化酶（SOD）活性均顯著下降，而自由基作用于脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量顯著上升（P<0.01），這表明酒精引起小鼠肝臟中過氧化物水平的顯著增加，并且抗氧化能力下降，提示造模成功。陽(yáng)性對(duì)照組、溪黃草組能夠顯著提高ALD小鼠肝臟、血清中GSH-px、SOD的活性（P<0.05），不同程度地降低MDA的含量（P<0.05），提示溪黃草水提物能促進(jìn)GSH-px、SOD的活性，有效防止酒精攝入引起的小鼠肝細(xì)胞過度氧化，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，且能不同程度的降低MDA的含量。結(jié)果見表4、5。

4 討論

經(jīng)胃腸道吸收的酒精90%～98%在肝臟中通過乙醇脫氫酶途徑、微粒體乙醇氧化系統(tǒng)、過氧化氫酶系統(tǒng)這3個(gè)途徑進(jìn)行代謝。在這氧化代謝過程中，產(chǎn)生的大量自由基介導(dǎo)了肝細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加了體內(nèi)的氧化水平，當(dāng)肝細(xì)胞中的氧化水平超過抗氧化水平時(shí)，就會(huì)破壞肝臟的細(xì)胞膜脂質(zhì)導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[10]。ALT、AST是肝細(xì)胞損傷的標(biāo)志，肝細(xì)胞損傷時(shí)，細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞通透性增加，使肝細(xì)胞中的 ALT 與AST進(jìn)入血液進(jìn)而引起血清中ALT 與AST的升高[11]。機(jī)體內(nèi)存在包括 SOD 等酶類及包括還原型谷胱甘肽（GSH-px）等非酶類兩大抗氧化防御體系，以清除氧自由基，阻斷組織過氧化損傷;MDA 是活性氧自由基氧化生物膜過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其水平的高低與氧化應(yīng)激對(duì)肝臟的損害程度相關(guān)[12-13]。溪黃草唇含有二萜類、黃酮類等重要的有效成分，而二萜類化合物經(jīng)過藥理篩選證實(shí)其具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗炎等多種生物活性，其作用機(jī)制與肝臟線粒體的保護(hù)、肝臟內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控相關(guān);黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、抗病原微生物等藥理活性，對(duì)肝臟損傷有較好的保護(hù)作用[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)溪黃草水提物進(jìn)行了保肝作用及機(jī)制的研究，結(jié)果初步顯示，與空白組比較，模型小鼠體肝臟明顯腫大，血清ALT、AST 水平增加，肝指數(shù)增大，肝組織MDA含量顯著增加，SOD、GSH-px 活性顯著降低，提示模型小鼠肝功能受損且可能存在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時(shí)也說明造模成功。給予溪黃草水提物進(jìn)行干預(yù)，能有效拮抗模型小鼠肝臟質(zhì)量增加，降低肝組織 MDA 水平，提高 SOD、GSH-px 活性，改善肝腫大;肝組織外觀觀察顯示，溪黃草水提物組小鼠肝臟受損情況改善明顯，可減輕肝臟病變狀態(tài)，逐漸恢復(fù)接近陽(yáng)性對(duì)照組的肝臟情況。而且溪黃草組小鼠體重顯著減少，由此可以推測(cè)溪黃草通過調(diào)節(jié)機(jī)體氧化酶系統(tǒng)影響了脂肪代謝途徑，這可能是預(yù)防急性肝損誘發(fā)脂肪肝的保護(hù)機(jī)制。因此認(rèn)為溪黃草能抑制肝功能指標(biāo)水平的上升、保護(hù)肝細(xì)胞以及有效改善肝功能，為防治急性酒精性肝損傷的作用機(jī)制之一[16-18]。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)溪黃草水提物可增強(qiáng)GSH-px、SOD活性并阻止酒精引起的MDA升高，從而降低氧化應(yīng)激所引起的肝細(xì)胞損傷，結(jié)果提示，抗氧化作用可能是溪黃草水提物對(duì)ALD小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制之一。

綜上，溪黃草水提物護(hù)肝機(jī)制主要是通過降低機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制肝功能指標(biāo)水平的增加，改善肝臟病變情況，也將為深入研究其保肝通路機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-06-08 編輯：劉 斌）