病毒性肝炎樹鼩動(dòng)物模型研究與建模策略

龐義全，馮悅，孫曉梅，劉麗，代解杰，夏雪山

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118)

病毒性肝炎嚴(yán)重危害人類的健康，據(jù)世衛(wèi)組織最新數(shù)據(jù)顯示，全球約有20 億人感染肝炎病毒(包括病毒攜帶者和患者)，每年約有80～100 萬人死于病毒性肝炎感染相關(guān)疾病。我國(guó)屬于肝炎的中度流行區(qū)，每年有超過130 萬人感染病毒性肝炎，占傳染病總數(shù)的1/3。由于合適的動(dòng)物模型的缺乏，諸如丙型肝炎等感染性高的病毒性肝炎類型，至今尚無有效的疫苗和可治愈策略［1］。人和黑猩猩是多種肝炎病毒的自然宿主，但黑猩猩數(shù)量稀少、價(jià)格昂貴以及倫理道德等原因，很難用于模型研究。研究者多用小鼠來研究肝炎病毒，并通過轉(zhuǎn)基因及肝細(xì)胞移植等手段提高小鼠對(duì)病毒的感染性，但由于小鼠與人類親緣關(guān)系差距較大，病毒感染后的病理變化機(jī)制也存在較大差異，即使病毒可有效感染，并未產(chǎn)生典型的肝炎癥狀［2］。最近研究顯示，樹鼩可以感染乙型、丙型等肝炎病毒，因而也就為其發(fā)展成為病毒性肝炎動(dòng)物模型提供了可能［3］。本文就病毒性肝炎樹鼩模型研究情況及可能的建模策略作一綜述。

1 病毒性肝炎

病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的肝臟疾病，肝炎病毒都以肝細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，主要通過病毒感染和免疫病理變化侵害肝組織，臨床表現(xiàn)為急慢性肝炎、肝硬化、乃至肝癌。肝炎病毒主要有甲型、乙型、丙型、丁型、戊型等五種病毒，分別屬于不同病毒科，具有不同的生物學(xué)特性(表1)。

表1 各型肝炎病毒及特點(diǎn)Tab.1 Different hepatitis viruses and their characteristics

甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒屬于糞－口傳播的爆發(fā)型流行病毒，主要表現(xiàn)為急性感染，極少數(shù)會(huì)轉(zhuǎn)為慢性化。隨著醫(yī)療衛(wèi)生條件改善，甲型和戊型肝炎感染與發(fā)病率顯著下降。丁型肝炎病毒是一種缺陷病毒，只能在嗜肝性DNA 病毒輔助下才能復(fù)制。乙型肝炎病毒屬于嗜肝性DNA 病毒，主要通過血液、母嬰以及其他體液傳播，感染后容易產(chǎn)生慢性化。我國(guó)是乙型肝炎患病人數(shù)最多的國(guó)家，約有1.2 億人攜帶HbsAg［4］。丙型肝炎病毒屬于黃病毒科單股正鏈RNA 病毒，我國(guó)目前大約有4300 萬人感染丙型肝炎病毒，其傳播途徑與乙型肝炎病毒類似。至今，對(duì)乙型肝炎和丙型肝炎都尚無有效的治療方式，主要原因在于缺乏合適的動(dòng)物模型來進(jìn)行病毒致病機(jī)理研究和疫苗、藥物研發(fā)。

2 病毒性肝炎模型研究近況

除人之外，只有黑猩猩是多種肝炎病毒的自然宿主，感染后表現(xiàn)出與人類相似的疾病癥狀，是最為合適的肝炎病毒動(dòng)物模型，但由于其屬于瀕危動(dòng)物、價(jià)格昂貴及倫理道德原因，難以廣泛使用。甲型肝炎動(dòng)物模型主要有鷹猴模型［5］、豚鼠模型［6］、白須狨猴模型［7］、普通狨猴模型［8］和食蟹猴動(dòng)物模型［9］等。豚鼠模型已被用甲肝發(fā)病機(jī)制研究和疫苗的評(píng)價(jià);白須狨猴模型也被用于甲型肝炎疫苗開發(fā);甲型肝炎病毒口服接種狨猴，在糞便中可檢測(cè)到HAV RNA，可用于疫苗保護(hù)性和抗病毒藥物試驗(yàn)。丁型肝炎動(dòng)物模型主要有土撥鼠模型［10］、人源化uPA/SCID 小鼠模型［11］和移植肝細(xì)胞小鼠模型［12］。土撥鼠動(dòng)物模型可用于HDV 感染后發(fā)病機(jī)制研究及疫苗開發(fā);人源化uPA/SCID 小鼠模型已被用于抗病毒藥物的臨床前藥物評(píng)價(jià);移植肝細(xì)胞小鼠模型更多用于感染發(fā)病機(jī)制研究。戊型肝炎動(dòng)物模型主要為食蟹猴［13］、非洲綠猴［14］等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，已用于發(fā)病機(jī)制研究和疫苗試驗(yàn);另外，SD 大鼠［15］、豬［16］、兔［17］、沙鼠［18］等也可用于戊型肝炎病毒感染方面的研究。

乙型肝炎動(dòng)物模型主要有鴨模型、土撥鼠模型和小鼠模型。由于鴨乙型肝炎病毒(DHBV)可感染鴨子，產(chǎn)生類肝炎癥狀，鴨模型可用于評(píng)價(jià)抗病毒藥物治療效果［19］。但由于鴨HBV 和人HBV 在結(jié)構(gòu)上差別較大，不能很好的再現(xiàn)人HBV 感染過程。土撥鼠肝炎病毒(WHV)基因結(jié)構(gòu)及致病特性等方面與HBV 類似，被該病毒感染的土撥鼠也被用于HBV 感染機(jī)制研究及疫苗開發(fā)［20］。HBV 小鼠模型主要為轉(zhuǎn)基因小鼠模型(包括全基因組轉(zhuǎn)染模型［21］、亞基因組轉(zhuǎn)染模型［22］)、人鼠嵌合肝模型(NOD/SCID 小鼠模型［12］、uPA/SCID 小鼠模型［23］、MUP－uPA/SCID/Bg 小鼠模型［24］)以及水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染小鼠模型［25］。轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以用于抗原耐受機(jī)制及致病機(jī)理研究，但很難用于病毒侵入、傳播及抗病毒藥物的研究。人鼠嵌合肝模型可以用于HBV 感染及肝癌發(fā)生機(jī)制的研究，但由于小鼠免疫特性與人相差較大，很難用于病毒后的免疫致病機(jī)制研究。水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染模型則是通過水動(dòng)力法將HBV DNA 快速注入到小鼠肝臟，使肝細(xì)胞感染HBV，并發(fā)現(xiàn)感染后癥狀，其一定程度上可用于HBV 復(fù)制周期研究及抗病毒藥物篩選。

丙型肝炎動(dòng)物模型主要有猴模型和小鼠模型。夏寧邵等［26］在獼猴體內(nèi)植入人肝細(xì)胞，使獼猴可被HCV 感染，但很難用于HCV 致病機(jī)制的研究。最近，Sourisseau 等［27］將豚尾猴干細(xì)胞分化成的肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)此細(xì)胞可支持HCV 感染和復(fù)制，為動(dòng)物模型建立開創(chuàng)了新的途徑。小鼠模型主要有轉(zhuǎn)基因小鼠模型和肝移植小鼠模型。轉(zhuǎn)基因小鼠是將HCV 結(jié)構(gòu)基因或者HCV 受體基因轉(zhuǎn)至小鼠體內(nèi)，使小鼠具有對(duì)HCV 的易感性，可用于致病機(jī)理等方面的研究［28，29］，但由于免疫特性的種間差異，很難用于致病過程的研究。肝細(xì)胞移植小鼠模型則是將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)(如Trimera 小鼠模型［30］、uPA/SCID 小鼠模型［31］、MUP－uPA/SCID/Bg小鼠模型［24］)，可使HCV 病毒感染并支持其增殖，已用于HCV 感染與增殖特性研究及抗病毒藥物篩選。

盡管靈長(zhǎng)類及嚙齒類在病毒性肝炎疾病動(dòng)物模型的研究與應(yīng)用方面已取得較大進(jìn)展，但靈長(zhǎng)類繁育難度大、操作繁瑣、價(jià)格昂貴，而嚙齒類動(dòng)物與人之間較大的種間遺傳差異，導(dǎo)致病毒的感染與致病特性也因此不同，急需尋找一種與人遺傳與生理差距小，且易于獲得的小動(dòng)物模型。樹鼩(Tupaia)被分類為哺乳綱、攀鼩類的小型哺乳動(dòng)物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)主要分布在云南、廣西、海南等地。樹鼩個(gè)體小，繁殖快，易于獲得，且生理機(jī)能和新陳代謝較嚙齒類更接近于人類，已用于多種人類疾病模型研究，尤其因其能被HBV 和HCV 等肝炎病毒感染而備受關(guān)注。

3 樹鼩作為病毒性肝炎模型研究近況

3.1 甲型、丁型、戊型肝炎病毒樹鼩動(dòng)物模型

Zhan 等［32］首次用樹鼩進(jìn)行甲型肝炎動(dòng)物模型研究，用甲型肝炎患者糞便過濾物通過飼喂感染樹鼩，在樹鼩體內(nèi)及排泄物中可檢測(cè)到甲型肝炎病毒。丁型肝炎病毒屬于缺陷型病毒，其復(fù)制需依賴于乙型肝炎病毒的輔助。Li 等［33］建立了丁型肝炎/乙型肝炎樹鼩感染模型，并發(fā)現(xiàn)樹鼩病理變化過程與黑猩猩感染類似，證實(shí)樹鼩可以作為丁型肝炎動(dòng)物模型。蔣雷等［34］用戊型肝炎病毒(HEV)靜脈注射感染樹鼩，7 天后可檢測(cè)到血液中HEV RNA，并發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)相關(guān)的病理變化，證實(shí)樹鼩有可能成為戊型肝炎動(dòng)物模型。

3.2 乙型肝炎病毒樹鼩動(dòng)物模型

早在1984 年，嚴(yán)瑞琪等［35］用人HBV 陽性血清分別經(jīng)靜脈和腹腔注射感染樹鼩，感染后檢測(cè)顯示，7/10 只樹鼩血清出現(xiàn)HBsAg 陽性，首次表明樹鼩可被HBV 感染。隨后，Walter 等［36］用HBV DNA 陽性血清感染樹鼩原代肝細(xì)胞及新生、成年樹鼩，原代肝細(xì)胞在感染后5～6 d 能檢測(cè)到HBsAg 和HBeAg;新生樹鼩在感染后2～4 周能檢測(cè)到HBsAg以及多種特異性抗體，并出現(xiàn)類似人的急性肝炎癥狀，但10 只成年樹鼩感染后僅表現(xiàn)為一過性感染。Wang 等［37］用HBV 陽性血清感染新生樹鼩，46 只新生樹鼩中有6 只建立了慢性感染，且出現(xiàn)類似乙型肝炎癥狀及相應(yīng)的組織病理變化，說明樹鼩模型可用于進(jìn)行乙型肝炎病程和致病機(jī)制研究。Ren等［38］用重組的Ad－HBV1.3 和AdGFP－HBV1.3 病毒感染樹鼩原代肝細(xì)胞，能檢測(cè)到HBsAg、HBeAg、HBV DNA 和HBV 包膜蛋白的表達(dá)。曾揚(yáng)等［39］利用重組腺相關(guān)病毒為載體使HBV 全基因在樹鼩肝臟中表達(dá)，建立了HBV 急性感染樹鼩動(dòng)物模型。最近，Ping 等［40］用HBV 陽性血清感染新生樹鼩發(fā)現(xiàn)，樹鼩可以被HBV 感染，肝組織出現(xiàn)與乙型肝炎患者類似的病理變化。以上結(jié)果顯示，樹鼩可以被HBV感染，并且出現(xiàn)典型的感染癥狀與病理變化，有望成為理想的乙型肝炎動(dòng)物模型。

3.3 丙型肝炎樹鼩動(dòng)物模型

1998 年，劉志等［41］就用HCV RNA 陽性血清靜脈注射感染成年樹鼩，可以在被感染動(dòng)物血清中間歇性檢測(cè)到HCV RNA，首次發(fā)現(xiàn)樹鼩可能對(duì)HCV易感。同時(shí)，Xie 等［42］用HCV 1b 型陽性血清感染23 只樹鼩，發(fā)現(xiàn)8 只樹鼩出現(xiàn)間歇性感染，而用1a、1b、3 型HCV 混合血清感染樹鼩，發(fā)現(xiàn)經(jīng)輻照樹鼩出現(xiàn)持續(xù)病毒血癥，進(jìn)一步證實(shí)樹鼩可以被HCV 感染。Zhao 等［43］用丙型肝炎患者血清感染樹鼩原代肝細(xì)胞，收取上清進(jìn)行傳代培養(yǎng)，兩次傳代均能在培養(yǎng)上清中檢測(cè)到HCV RNA，并在其中發(fā)現(xiàn)HCV 病毒的準(zhǔn)種變化，證實(shí)體外培養(yǎng)的樹鼩原代肝細(xì)胞也可以被HCV 感染并支持其復(fù)制。Xu 等［44］用1b、2c、3b 和6 型四種基因型混合的HCV 血清感染樹鼩，18 只樹鼩有16 只被感染，其中12 只建立了慢性感染。Amako 等［45］用培養(yǎng)HCV 病毒和臨床病毒株感染樹鼩，經(jīng)長(zhǎng)達(dá)三年的連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)樹鼩可以建立慢性感染，感染樹鼩會(huì)出現(xiàn)間歇性病毒血癥、肝脂肪變性、肝臟纖維化及肝細(xì)胞癌等組織病理學(xué)變化。盡管由于樹鼩來源不同及種系差別大、遺傳不穩(wěn)定等因素，導(dǎo)致樹鼩對(duì)HCV 感染率不穩(wěn)定，不同研究發(fā)現(xiàn)的感染與致病現(xiàn)象也不盡相同，但已有報(bào)道均可確定樹鼩可以被HCV 感染，并且出現(xiàn)慢性肝炎相關(guān)癥狀，有望成為合適的丙型肝炎動(dòng)物模型［46］。

4 肝炎病毒對(duì)樹鼩感染與致病的宿主影響因素

病毒對(duì)宿主的感染及致病除受到病毒基因所決定的感染力與致病性等病毒因素外，還受到細(xì)胞內(nèi)小RNA、病毒感染細(xì)胞表面受體及其他宿主影響因素影響(見圖1)。

4.1 細(xì)胞內(nèi)小RNA

細(xì)胞內(nèi)小RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約21 到23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。miRNA 通過與信使RNA 特異結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，并且miRNA 在病毒感染中起到一定作用。在諸多的miRNA 中，與HCV 感染有關(guān)的主要有miR－122、miR－199a* 、miR－29 和miR－27a 等。miR－122 在HCV 感染中起到至關(guān)重要的作用，能夠促進(jìn)HCV RNA 的復(fù)制［47］;上調(diào)miR－199a* 、miR－29 或miR－27a 則可抑制HCV 在細(xì)胞中的復(fù)制［48－50］。而與HBV 有關(guān)的miRNA 主要有miR－122、miRs－372/373、miR－501、miR－141 和miR－155等。miR－122 在HBV 感染樹鼩肝細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)表達(dá)量提高［51］;miRs－372/373 通過靶向核因子I/B 促進(jìn)HBV 的表達(dá)［52］;miR－501 能夠促進(jìn)HBV 的復(fù)制［53］，相反miR－141 則能抑制HBV 的復(fù)制［54］;miR－155 能夠提高機(jī)體的免疫，從而抑制HBV 的感染［55］。不同種類的miRNA 在肝炎病毒感染及復(fù)制過程中具有不同的作用。

4.2 肝炎病毒受體分子

肝炎病毒必須通過與宿主細(xì)胞表面受體分子結(jié)合，才能完成病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染。目前，乙型、丙型肝炎病毒受體研究已有了較大進(jìn)展。

HBV 受體研究從70 年代就已開始，早期認(rèn)為多聚人血清白蛋白(PHSA)［56］、細(xì)胞因子修飾的血清蛋白(MSA)［57］、HBV 結(jié)合因子(HBV BF)［58］、p80 蛋白［59］、白介素－6(IL－6)［60］、多聚IgA 受體［61］以及人肝細(xì)胞附加素［62］都可能是HBV 受體。也發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞表面游離分子可與HBV 相結(jié)合，可能參與介導(dǎo)HBV 對(duì)肝細(xì)胞的感染，但這些分子對(duì)介導(dǎo)感染特性與分子機(jī)制仍不清楚。李文輝等［63］在HBV感染樹鼩原代肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，牛黃膽酸鈉共轉(zhuǎn)移多肽(NTCP)可與HBV 前S1 蛋白域結(jié)合。把人或樹鼩NTCP 轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞，使其具有對(duì)HBV 易感，沉默肝細(xì)胞中的NTCP 則降低HBV 對(duì)肝細(xì)胞的感染，證實(shí)NTCP 是HBV 感染細(xì)胞的受體。牛黃膽酸鈉共轉(zhuǎn)移多肽(NTCP)是一種具有膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的多肽類物質(zhì)，主要負(fù)責(zé)肝臟內(nèi)的膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)，其作為乙型肝炎病毒細(xì)胞受體新功能確定，對(duì)動(dòng)物模型的建立研究、靶向藥物的研發(fā)起到重要的推動(dòng)作用。

HCV 通過宿主細(xì)胞的多種表面蛋白分子介導(dǎo)感染肝細(xì)胞，已確定的受體主要包括四次跨膜素成員CD81［64］、B 族I 型清道夫受體SR－BI［65］、細(xì)胞緊密連接蛋白 claudin－1(CLDN1)［66］和 occludin(OCLN)［67］，氨基葡聚糖(GAGs)、低密度脂蛋白受體(LDLr)、凝集素分子(DC－SIGN 和L－SIGN)等其他分子也有一定的感染輔助作用。CD81 是四次跨膜蛋白家族成員，其大胞外環(huán)是介導(dǎo)HCV 感染的關(guān)鍵區(qū)域。我們克隆了樹鼩CD81 分子基因，經(jīng)序列測(cè)定與分析發(fā)現(xiàn)，樹鼩CD81 分子與人氨基酸序列同源性高達(dá)96%，與E2 結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)樹鼩和人完全一致［43］。SR－BI 是另一種介導(dǎo)HCV 進(jìn)入細(xì)胞的受體分子，樹鼩SR－BI 與人的氨基酸序列同源性為88%，Barth 等［68］將樹鼩SR－B1 基因轉(zhuǎn)入CHO 細(xì)胞中，證實(shí)樹鼩SR－B1 可與E2 蛋白結(jié)合，并介導(dǎo)病毒入胞。Claudin－1 作為介導(dǎo)HCV 入胞的受體分子，樹鼩claudin－1 和人的該分子氨基酸序列同源性達(dá)93%，Tong 等［69］發(fā)現(xiàn)樹鼩claudin－1 可提高細(xì)胞對(duì)HCVpp 的易感性。樹鼩occludin 分子和人的氨基酸序列同源性為88%，與HCV 結(jié)合關(guān)鍵區(qū)域的45 個(gè)氨基酸位點(diǎn)僅有4 個(gè)與人不同，將樹鼩occludin分子與人CD81、SR－BI、claudin－1 分子共轉(zhuǎn)染NIH3T3可高度介導(dǎo)HCVpp 對(duì)細(xì)胞的感染［69］。以上結(jié)果，從HCV 受體序列同源性和介導(dǎo)功能的角度，佐證了樹鼩對(duì)HCV 易感，可以成為HCV 動(dòng)物模型。

4.3 其他宿主影響因素

腫瘤壞死因子－α 是一種系統(tǒng)性炎癥細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。Xu 等［70］發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子－α 的表達(dá)可抑制HBV 在肝細(xì)胞中的復(fù)制，不利于HBV 的感染。p53 基因可修復(fù)DNA 損傷，抑制細(xì)胞周期或誘導(dǎo)凋亡。Lee 等［71］發(fā)現(xiàn)p53 可抑制HBV 的復(fù)制，李強(qiáng)等［72］也發(fā)現(xiàn)HCV 的核心蛋白可與p53 相互作用。超氧化物歧化酶是一種能夠催化超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫，具有抗氧化作用，而谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶是谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵酶。Li等［73］發(fā)現(xiàn)銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)及谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶A1 基因(GSTA1)在肝炎患者中表達(dá)水平顯著下調(diào)。NF－κB 為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，參與免疫反應(yīng)的早期和炎癥反應(yīng)分子的調(diào)控，Guitart等［74］發(fā)現(xiàn)HCV 感染原代肝細(xì)胞后可下調(diào)NF－κB基因的表達(dá)。

圖1 調(diào)控病毒感染樹鼩Fig.1 Regulation of the viral infection in tree shrew

5 病毒性肝炎樹鼩建立策略

已有研究結(jié)果表明，樹鼩可以感染HBV 和HCV，但樹鼩對(duì)HBV 和HCV 病毒感染率低，不能達(dá)到穩(wěn)定感染。通過借鑒現(xiàn)有病毒感染率提高及基因操作、異種動(dòng)物建模技術(shù)，我們可以在樹鼩和病毒兩方面進(jìn)行改造和優(yōu)化，來提高病毒對(duì)樹鼩的感染性，以實(shí)現(xiàn)最終建立病毒性肝炎樹鼩動(dòng)物模型。

5.1 樹鼩個(gè)體的改造與優(yōu)化

肝炎病毒能自然感染人和黑猩猩，主要原因可能在于肝炎病毒對(duì)人和黑猩猩肝臟環(huán)境的適應(yīng)性。我們可以通過異種移植的方式，將人肝細(xì)胞移植到動(dòng)物體內(nèi)，為病毒提高合適的感染與復(fù)制環(huán)境，以提高病毒的感染性。比如，Tesfaye 等［24］將人肝細(xì)胞移植到MUP－uPA/SCID/Bg 轉(zhuǎn)基因小鼠上，發(fā)現(xiàn)人肝細(xì)胞可在小鼠肝臟內(nèi)生長(zhǎng)。這種肝細(xì)胞移植小鼠可以提高HBV 和HCV 的感染。Kosaka 等［75］發(fā)現(xiàn)TK－NOG 小鼠(基于胸腺激酶的小鼠)在注射鳥嘌呤后可支持人肝細(xì)胞的移植，并能對(duì)HBV 和HCV 易感，并可建立穩(wěn)定的感染，且能出現(xiàn)病毒血癥。而Ilan 等［30］則用無免疫系統(tǒng)的正常小鼠與SCID 小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行重構(gòu)，再將感染了HCV 的人肝細(xì)胞移植到鼠肝內(nèi)建立HCV 三聚體小鼠，發(fā)現(xiàn)HCV 感染率高達(dá)80%，并且在肝細(xì)胞中可檢測(cè)到HCV 負(fù)鏈的存在。這些鼠類肝細(xì)胞移植模型可提高病毒的感染與復(fù)制，而我們可借鑒這些建模策略，比如可以構(gòu)建成MUP－uPA/SCID/Bg 轉(zhuǎn)基因樹鼩和TK－NOG 樹鼩，再將人肝細(xì)胞移植到經(jīng)過改造的樹鼩體內(nèi)，有望提高病毒對(duì)樹鼩的感染性?；蛘咧苯訉⒒加懈窝撞《镜娜烁渭?xì)胞移植到免疫缺陷型的樹鼩體內(nèi)，構(gòu)建成類似的三聚體樹鼩，提高病毒感染性。通過此方式將有希望建成HBV 和HCV 高感染的樹鼩動(dòng)物模型。

牛黃膽酸鈉共轉(zhuǎn)移多肽(NTCP)已被證實(shí)是HBV 的受體，CD81、SR－BI、CLDN1 和OCLN 則是HCV 進(jìn)入細(xì)胞的受體，受體基因的高表達(dá)有助于相應(yīng)病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染。比如Dorner 等［76］用基因工程技術(shù)在小鼠體內(nèi)表達(dá)人CD81 和OCLN，發(fā)現(xiàn)該小鼠對(duì)HCV 易感。我們也可以借助基因工程技術(shù)在樹鼩肝組織中高表達(dá)人HBV 和HCV 的相應(yīng)受體分子，借助受體分子的表達(dá)來提高肝炎病毒對(duì)樹鼩的感染與致病性。

細(xì)胞內(nèi)存在著病毒復(fù)制的正調(diào)節(jié)因子及負(fù)調(diào)節(jié)因子，正調(diào)節(jié)因子的存在可提高病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及釋放，比如miR－122 可提高HCV 的翻譯和復(fù)制［47］。而負(fù)調(diào)節(jié)因子則可能在動(dòng)物體內(nèi)參與提高體內(nèi)的抗病毒反應(yīng)，使病毒蛋白失活導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞感染性下降，比如HCV 在PKR 缺失的鼠胚胎成纖維病毒細(xì)胞的復(fù)制遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在正常成纖維細(xì)胞中［77］。因此，我們可以借助基因工程手段，提高細(xì)胞中與病毒感染及復(fù)制有關(guān)的正調(diào)節(jié)因子的表達(dá)、降低或沉默負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，來提高病毒對(duì)樹鼩的感染與致病性。

5.2 病毒的改造與優(yōu)化

篩選獲得對(duì)異種動(dòng)物的適應(yīng)性病毒株，有助于提高病毒的感染、致病性和疾病模型的建立。已有研究已利用細(xì)胞傳代篩選、病毒基因改造等技術(shù)篩選出適應(yīng)性HCV 病毒株，提高了病毒對(duì)小鼠與狨猴的感染性。比如Bitzegeio 等［78］用高表達(dá)鼠CD81的Lunet N 細(xì)胞連續(xù)傳代HCV 病毒，篩選到可利用鼠CD81 感染細(xì)胞的HCV 病毒適應(yīng)株，并證實(shí)由于囊膜蛋白與P7 蛋白的部分氨基酸發(fā)生了變異，使病毒獲得對(duì)異種細(xì)胞感染能力。我們可借鑒此方法，用樹鼩CD81 在Lunet N 細(xì)胞中表達(dá)，篩選出適應(yīng)樹鼩CD81 的HCV 病毒株，并用適應(yīng)性病毒株在樹鼩原代肝細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)，進(jìn)一步優(yōu)化病毒，有望提高肝炎病毒對(duì)樹鼩的感染性和致病性。

Li 等［79］采用基因工程技術(shù)將HCV 的核心和包膜蛋白或者是完整的膜蛋白替換為GBV－B 對(duì)應(yīng)基因片段，構(gòu)建了HCV/GBV－B 嵌合病毒，使嵌合病毒具備了對(duì)GBV－B 自然宿主狨猴的感染性。因此，我們也可以利用與肝炎病毒同類并且可以自然感染樹鼩的病毒，構(gòu)建嵌合病毒，提高肝炎病毒對(duì)樹鼩的感染性。

病毒在樹鼩體內(nèi)不能穩(wěn)定感染的主要原因可能還在于病毒不能適應(yīng)樹鼩肝細(xì)胞的環(huán)境，導(dǎo)致病毒在細(xì)胞中復(fù)制較低，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的感染性病毒。我們可以開發(fā)出體內(nèi)選擇系統(tǒng)，來提高病毒的復(fù)制能力。有研究報(bào)道，在病毒基因組中嵌入FAH 選擇標(biāo)記基因，與FAH 缺失小鼠可產(chǎn)生互補(bǔ)的選擇性，通過選擇壓力，促使病毒基因組在FAH 缺失小鼠肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，提高病毒的感染性［80］。我們也可將樹鼩肝細(xì)胞中FAH 基因敲出，利用病毒與細(xì)胞的互補(bǔ)選擇性提高病毒在樹鼩肝細(xì)胞中的復(fù)制，來提高病毒對(duì)樹鼩肝細(xì)胞的感染性。

6 展望

疾病動(dòng)物模型對(duì)于研究病原體感染與致病機(jī)制，以及藥物與疫苗的研發(fā)均具有重要意義。理想的動(dòng)物模型應(yīng)能使病毒易于建立感染，產(chǎn)生與人類感染相應(yīng)肝炎病毒相同、至少相似的疾病過程與癥狀。從分子水平來看，樹鼩的HBV 和HCV 受體與人同源性高，尤其是關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)高度一致，并可介導(dǎo)病毒的感染，為樹鼩發(fā)展成為合適的動(dòng)物模型提供了良好的佐證。目前為止，雖然樹鼩對(duì)于HBV、HCV 感染率仍較低，難以建立慢性感染，但隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)、基因工程技術(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，樹鼩有望發(fā)展成為合適病毒性肝炎動(dòng)物模型，為這些疾病感染與致病機(jī)制研究、藥物與疫苗研發(fā)提供技術(shù)支撐。

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