雷公藤多苷提取物中主要有效部位的含量比較*

何 昱 石森林 張茹萍 范永升 王新昌

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

雷公藤多苷是中藥雷公藤的去皮根經(jīng)提取分離得到的活性組分混合物。雷公藤多苷的生理活性由二萜類、三萜類、生物堿類等多種成分協(xié)同產(chǎn)生［1］，但這些雷公藤多苷的有效成分也是其毒性成分［2-3］，引發(fā)了臨床上的眾多不良反應(yīng)［4-5］。由于目前國(guó)內(nèi)對(duì)雷公藤多苷提取物及制劑仍缺乏較為完善的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步合理應(yīng)用雷公藤多苷，本研究應(yīng)用紫外可見(jiàn)分光光度法對(duì)不同廠家的雷公藤多苷提取物中總二萜、總?cè)?、總生物堿3個(gè)有效部位進(jìn)行了含量測(cè)定，以期為臨床應(yīng)用雷公藤多苷的安全有效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

METTLER AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （島津，江蘇）；雷公藤甲素（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111567-200502）、雷公藤紅素（貴州迪大科技有限責(zé)任公司，批號(hào)A0106）、雷公藤次堿（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，批號(hào)201012），層析用中性氧化鋁（100-200目，上海五四化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)100311），其他所用試劑均為分析純。雷公藤多苷提取物（西安天本生物工程有限公司，批號(hào)TBT111106、TBT110412、TBT110801、TBT110624、TBT111026、TBC111201、TBC110927；湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號(hào)20101209、20101108；桂林市三棱生物制品有限公司，批號(hào) 100808）。

2 方法與結(jié)果

2．1 總二萜的含量測(cè)定［6］

2．1．1 溶液制備 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取雷公藤甲素對(duì)照品5．0mg，加甲醇溶解并定容于5mL的容量瓶中，得質(zhì)量濃度為1．0mg/mL的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：精密稱取雷公藤多苷提取物0．15 g，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至25mL容量瓶中，即得。

2．1．2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各2．0mL，冰水浴中冷卻后加入2%3，5-二硝基苯甲酸溶液 2．0 mL和 2mol/L KOH溶液 2．0 mL，冰水浴中放置10min后，自來(lái)水沖淋2min。以無(wú)水乙醇加顯色劑為空白，在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果對(duì)照品與供試品在544 nm處均有最大吸收，故選擇544 nm作為雷公藤多苷樣品中總二萜的檢測(cè)波長(zhǎng)（圖 1）。

圖1 雷公藤多苷中總二萜的可見(jiàn)吸收光譜圖

2．1．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密移取雷公藤甲素對(duì)照品溶液 0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．6mL 置于 10mL 容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，吸取5．0mL稀釋后的溶液于10mL容量瓶中，加入顯色劑，定容，在544 nm下測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，建立相應(yīng)的回歸方程為 A=20．289C+0．129，r=0．9998。

2．1．4 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為 0．05mg/mL的雷公藤甲素對(duì)照品溶液，按“2．1．2 項(xiàng)”下方法顯色后，連續(xù)測(cè)定6次吸光度值，其RSD=0．36%。

2．1．5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 批號(hào)20101209的雷公藤多苷樣品按“2．1．1項(xiàng)”下制備供試品溶液，顯色后每隔 5min測(cè)定吸光度值。結(jié)果35min內(nèi)8次測(cè)得的吸光度RSD=2．88%，40min 內(nèi) 9 次測(cè)得的 RSD=3．22%， 表明樣品溶液在顯色后35min內(nèi)較為穩(wěn)定，可以進(jìn)行含量分析。

2．1．6 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備6份批號(hào)20101209的雷公藤多苷供試品溶液，依法測(cè)定后計(jì)算含量，結(jié)果6份供試品溶液中總二萜含量的RSD=2．01%。

2．1．7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取 6份 0．075 g已知含量的雷公藤多苷樣品（批號(hào)20101209），分別加入相應(yīng)量的雷公藤甲素對(duì)照品，按“2．1．2項(xiàng)”下方法制備樣品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算得加樣回收率為 （100．48±2．41）%，RSD=2．40%。

2．1．8 樣品含量測(cè)定 各批次的雷公藤多苷提取物依法制備供試品溶液，顯色后在544 nm下測(cè)定吸光度值，計(jì)算其中總二萜的含量，結(jié)果如表1所示。

2．2 總?cè)频暮繙y(cè)定［7-8］

2．2．1 溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取雷公藤紅素對(duì)照品5．0mg，加甲醇溶解并定容于5mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1．0mg/mL的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：精密稱取雷公藤多苷提取物0．1 g，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得。

表1 不同廠家雷公藤多苷提取物中3個(gè)有效部位含量（mg，s）

表1 不同廠家雷公藤多苷提取物中3個(gè)有效部位含量（mg，s）

廠家 n西安天本 4 4批號(hào) 總二萜 總?cè)?總生物堿TBT110801 9．13±0．29 177．03±5．10 598．18±1．91 TBT110412 7．80±0．38 198．68±5．01 708．01±1．91 4 TBT111106 4．80±0．20 319．77±6．98 630．14±7．64 4 TBT110624 6．48±0．12 320．64±8．66 600．43±6．36 4 TBT111026 7．28±0．17 293．16±8．80 597．73±5．10 4 TBC111201 8．65±0．85 200．65±1．80 690．45±1．27 4 TBC110927 2．33±0．12 72．47±3．48 269．58±1．27湖南協(xié)力 4 20101209 10．79±0．14 210．91±5．39 338．48±8．27 4 20101108 9．34±0．058 226．35±5．18 521．22±3．82桂林三祾 4 100808 4．43±0．14 233．64±6．33 765．17±8．92

2．2．2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別精密移取對(duì)照品溶液和供試品溶液各 0．02mL，100℃水浴揮干， 加入 0．4mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和1．0mL高氯酸，搖勻后70℃水浴中加熱45min，自來(lái)水冷卻5min后再加入5．0mL冰醋酸，搖勻，10 min后，以冰醋酸為空白，在 400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果對(duì)照品溶液與供試品溶液在541 nm處均呈現(xiàn)最大吸收，在此波長(zhǎng)下，顯色劑對(duì)測(cè)定沒(méi)有干擾（圖2）。

圖2 雷公藤多苷中總?cè)频目梢?jiàn)吸收光譜圖

2．2．3 線性關(guān)系考察 精密移取雷公藤紅素對(duì)照品溶液 0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．6mL， 用甲醇稀釋并定容于10mL 容量瓶中。再精密移取 2．5mL，按“2．2．2 項(xiàng)下”顯色后測(cè)定541 nm處的吸光度值。以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得回歸方程A=25．183C+0．129，r=0．9998。

2．2．4 精密度試驗(yàn) 取1．0mg/mL的雷公藤紅素對(duì)照品溶液，顯色后連續(xù)測(cè)定6次吸光度值，其RSD=0．30%。

2．2．5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào) TBT111026的雷公藤多苷供試品溶液在顯色后1 h內(nèi)測(cè)定吸光度。結(jié)果40min內(nèi)7次測(cè)定的吸光度值RSD=2．48%，50min內(nèi)8次測(cè)定的RSD=3．22%，表明在顯色后40min內(nèi)樣品穩(wěn)定。

2．2．6 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)TBT111026的雷公藤多苷提取物，按“2．2．1項(xiàng)”下方法平行制備6份供試品溶液，依法測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，結(jié)果6份供試品溶液中總?cè)坪康腞SD=1．92%。

2．2．7 加樣回收率試驗(yàn) 取6份0．05g已知含量的雷公藤多苷樣品（批號(hào)TBT111026），分別加入相應(yīng)量的雷公藤紅素對(duì)照品，按“2．2．1項(xiàng)”下制備供試品溶液，依法顯色后測(cè)定， 得加樣回收率為 （99．30±2．39）%，RSD=2．41%。

2．2．8 樣品含量測(cè)定 各批次的雷公藤多苷提取物樣品依法顯色后在541 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算所得量減去總二萜的含量即為雷公藤多苷提取物中總?cè)频暮浚Y(jié)果如表1所示。

2．3 總生物堿的含量測(cè)定［9］

2．3．1 溶液制備 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取雷公藤次堿對(duì)照品5．0mg，加乙腈溶解并定容于5mL容量瓶中，配制成濃度為1．0mg/mL的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：精密稱取雷公藤多苷樣品0．15 g，置25 mL容量瓶中，加氯仿溶解并定容。精密移取2．0mL溶液，上3．5 g的中性氧化鋁層析柱，以60mL氯仿∶甲醇（97∶3）洗脫，洗脫液水浴揮干，殘?jiān)眉状紡?fù)溶后定容至50mL的容量瓶中。

2．3．2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別將對(duì)照品溶液和供試品溶液在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果對(duì)照品與供試品在225 nm、267 nm處均有最大吸收（圖3）。為避免225 nm處雷公藤二萜類及三萜類的較強(qiáng)吸收干擾，故最終選擇267 nm作為總生物堿的測(cè)定波長(zhǎng)。

圖3 雷公藤多苷中總生物堿的紫外吸收光譜圖

2．3．3 線性關(guān)系考察 精密吸取雷公藤次堿對(duì)照品溶液 0．5、0．6、0．7、0．8、0．9、1．0mL 置 10mL 容量瓶， 用甲醇稀釋后定容，測(cè)定267 nm處吸光度。以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程A=4．629C+0．0305，r=0．9996。

2．3．4 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為 0．05mg/mL的雷公藤次堿對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定6次吸光度，其RSD=0．041%。

2．3．5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)20101108的雷公藤多苷供試品溶液， 分別于制備好后的 0、2、4、6、8、10、24 h，測(cè)定267 nm處的吸光度，結(jié)果24 h內(nèi)RSD為0．23%，表明供試液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．3．6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)20101108的雷公藤多苷6 份，按“2．3．1 項(xiàng)”下方法平行制備 6 份供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算得含量的RSD=2．19%。

2．3．7 加樣回收率試驗(yàn) 取 6份 0．075g已知含量的雷公藤多苷提取物（批號(hào)20101108），分別加入相應(yīng)量的雷公藤次堿對(duì)照品，依法測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，得加樣回收率為（100．32±2．22）%，RSD=2．21%。

2．3．8 樣品含量測(cè)定 各批次的雷公藤多苷提取物按“2．3．1 項(xiàng)”下制備供試品溶液，依法測(cè)定，根據(jù)回歸方程計(jì)算得雷公藤多苷提取物中總生物堿的含量，如表1所示。

3 討 論

3．1 檢測(cè)指標(biāo)的確定 課題組在以往研究中已對(duì)雷公藤多苷提取物中的雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲等單體組分進(jìn)行了HPLC含量測(cè)定［10］。但是，雷公藤多苷中眾多的化學(xué)成分均有生物活性和毒性的報(bào)道，光憑單一成分并不能完全代表其藥效、毒性等作用［11］，因此本研究應(yīng)用紫外可見(jiàn)分光光度法對(duì)雷公藤多苷中總二萜、總?cè)萍翱偵飰A3個(gè)有效部位進(jìn)行了含量測(cè)定，以更全面地反映雷公藤多苷的化學(xué)組成情況。

3．2 定量結(jié)果的比較 從各批次雷公藤多苷提取物的測(cè)定結(jié)果來(lái)看，3個(gè)有效部位中，總二萜的含量最低，其次為總?cè)?，總生物堿的含量最高。同時(shí)，在3個(gè)廠家的各批次樣品間，有效部位的最高含量與最低含量之間分別相差 4．6 倍、4．4 倍和 2．6 倍。雷公藤多苷作為治療指數(shù)較小的藥物［12］，其組成成分含量上的顯著差異值得引起相關(guān)生產(chǎn)廠家的重視。

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