三七總皂苷誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡及對Caspase-3表達(dá)的影響

目的觀察三七總皂苷（PNS）對人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞的增殖、凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響。方法用不同濃度PNS作用于U937細(xì)胞，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡，Western-blot法檢測Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果PNS抑制U943細(xì)胞生長并呈時間和劑量依賴性；分別予100、200、400、800mg/L處理U937細(xì)胞48h，細(xì)胞凋亡率分別為（5.93±0.15）%、（7.43±0.70）%、（12.3±0.38）%和（20.4±0.91）%，對照組細(xì)胞凋亡率為（1.73±1.50）%（P＜0.01），并誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯；Western-blot結(jié)果顯示，PNS使Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)論P(yáng)NS能抑制U937細(xì)胞增殖，并可能通過上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

三七總皂苷；U937細(xì)胞；凋亡；Caspase-3

三七總皂苷（panax notoginseng saponis，PNS）是從五加科人參屬多年生草本植物三七中提取的主要有效成分，有活血祛瘀，活絡(luò)通脈等功效。近年來，許多實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，PNS對肝癌、胃癌、前列腺癌、婦科腫瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多種腫瘤具有抗腫瘤作用[1-5]。但PNS對人急性單核細(xì)胞白血病的研究資料甚少。本文采用不同濃度PNS作用于人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937，觀察其對U937細(xì)胞增殖及凋亡的影響，為進(jìn)一步研究PNS抗白血病作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，旨在擴(kuò)展急性髓性白血病的輔助治療方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥物及材料 人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；PNS凍干粉針劑購自廣西梧州制藥有限公司；IMDM培養(yǎng)基購自Gibco公司；新生牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜（DSMO）、四甲基偶氨唑藍(lán)（MTT）購自Sigma公司；細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測試劑盒購自Invitrogen公司；一抗購自Santa Crusz公司。

1.2主要儀器及設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo），酶標(biāo)儀（BioTek，ELx808IU），流式細(xì)胞儀（BD），電泳槽、電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-Rad）

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將U937細(xì)胞接種于含10%新生牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天換液1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2分 組 設(shè)實(shí)驗(yàn)組和空白對照組。PNS按劑量不同分為50、100、200、400、800、1600、3200mg/L七組，未加藥組為對照組。

2.3細(xì)胞生長抑制率測定 采用噻唑藍(lán)（MTT）還原法進(jìn)行檢測。將1×105/mL濃度的U937細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200μL，每組設(shè)6個平行孔。分別作用于24、48、72h后，加入MTT（濃度5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液，每孔加入DMSO150μL，在自動酶標(biāo)儀上進(jìn)行比色（測試波長490nm），自動記錄每孔吸光度（D）值，計算不同濃度PNS對U937細(xì)胞的生長抑制率：抑制率（%）=[（對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對照組OD值]×100%。

2.4流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞周期和凋亡率

收集U937細(xì)胞，離心1000rpm，5min，去培養(yǎng)基，冷PBS洗滌1次。用1×Annexin-binding buffer重懸細(xì)胞約1×106/mL，取100uL，加5μL Annexin V和1μL 100μg/mL PI，室溫5min，加400μL1×Annexin-binding buffer，輕輕混勻，放于冰上，進(jìn)行FCM分析。

2.5Western-blot法檢測Caspase-3蛋白 收集細(xì)胞，PBS洗滌，抽提細(xì)胞裂解液。蛋白上樣量40μg，SDS-PAGE電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移，1%BSA封閉，1h。一抗1：1000稀釋，1.5h；二抗1：8000稀釋，1h，ECL顯影。

2.6統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)用（） 表示，應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1PNS對U937細(xì)胞增殖的影響 PNS對U937細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，并且隨濃度增加，作用時間延長，細(xì)胞抑制率明顯升高（P＜0.05）。不同濃度PNS作用于U937細(xì)胞48h，隨著PNS濃度增加抑制率增加，100mg/L以上濃度可明顯抑制U937細(xì)胞增殖（P＜0.01），見表1。

表1 PNS對U937細(xì)胞增殖的影響（n=3，）

表1 PNS對U937細(xì)胞增殖的影響（n=3，）

注：與對照組比較，*P＜0.01

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3.2PNS對U937細(xì)胞周期和凋亡的影響 分別用100、200、400、800mg/L的PNS處理U937細(xì)胞48h后，誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯，停留于G1期的細(xì)胞增加，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為（5.93±0.15）%、（7.43±0.70）%、（12.3±0.38）%和（20.4±0.91）%，對照組細(xì)胞凋亡率為(1.73±1.50%)（P＜0.01），呈劑量依賴性方式，見表2，圖1（封二）。

表2 不同濃度PNS作用于U937細(xì)胞后細(xì)胞周期分布（n=3，） %

表2 不同濃度PNS作用于U937細(xì)胞后細(xì)胞周期分布（n=3，） %

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3.3PNS對U937細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

用不同濃度PNS作用于U937細(xì)胞72h，Caspase-3蛋白的表達(dá)隨濃度增加逐漸上調(diào)，見圖2（封二）。

4 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡調(diào)控和細(xì)胞增殖調(diào)控紊亂密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡即程序性細(xì)胞死亡，主要有線粒體途徑、死亡受體介導(dǎo)途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)途徑。這三條途徑最終都會激活Caspase-3，Caspase-3是細(xì)胞凋亡反應(yīng)中的執(zhí)行者和關(guān)鍵酶，直接參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程[6]。通過活化脫氧核糖核酸酶，引起細(xì)胞染色體斷裂，發(fā)生細(xì)胞凋亡[7]。Caspase-3是真核細(xì)胞中的凋亡蛋白，屬半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，大多數(shù)的細(xì)胞凋亡與之相關(guān)[8]。

PNS是中藥三七的主要成分，廣泛應(yīng)用于心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及抗衰老等方面[8-10]。近年來，隨著國內(nèi)外學(xué)者不斷的深入研究，發(fā)現(xiàn)PNS具有多靶點(diǎn)抗腫瘤作用，可通過抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種方式發(fā)揮抗腫瘤作用[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)用PNS作用于人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PNS可以有效抑制U937細(xì)胞增殖，細(xì)胞生長抑制作用隨濃度增加及作用時間增加而增強(qiáng)。細(xì)胞周期分析顯示，PNS可以使G1期細(xì)胞含量較對照組增高，顯示G1期阻滯，并呈濃度依賴性。同時，PNS作用于U937細(xì)胞48h后，與對照組比較，100、200、400、800mg/L組均可顯著誘導(dǎo)U937細(xì)胞的凋亡。PNS可以使U937細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，并且隨濃度增加蛋白表達(dá)增強(qiáng)。

本研究結(jié)果表明，PNS具抑制U937細(xì)胞增殖的作用，呈時間和濃度依賴性，并能夠影響細(xì)胞周期，阻滯U937細(xì)胞于G1期，使Caspase-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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三七總皂苷誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡及對Caspase-3表達(dá)的影響

王 瀟 陳小紅 尹利明 高瑞蘭 浙江省中醫(yī)院 杭州310006

Effect of Panax Notoginseng Saponis on Apoptosis of and Caspase-3 in U937 cells

WANG Xiao，CHEN Xiaohong，YIN Liming，GAO Ruilan.Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of panax notoginseng saponis（PNS）on proliferation and apoptosis of human acute monocytic leukemia cell line U937 and the expression of caspase-3 in it.MethodsU937 cells were treated with PNS at different concentrations.Cell proliferation was analyzed by MTT assay.Cell cycle and apoptosis was assessed by flow cytometry,and the expression of Caspase-3 protein was detected by Western blot.ResultsThe inhibition of cell proliferation in U937 cells exposed to PNS was in a dose and time dependent manner.At 48 hours after exposure to 100，200，400，800 mg/L PNS，the apoptotic rates of U937 cells were（5.93± 0.15）%，（7.43±0.70）%，（12.3±0.38）%and（20.4±0.91）%，respectively，which were markedly higher than that of control group（1.73±1.50%，P＜0.01）.The exposure to PNS induced the G1 phase arrest of U937 cells and up-regulated the expression of Caspase-3 protein in U937 cells.ConclusionPNS can inhibit the proliferation of U937 cells and induce apoptosis by up-regulating the expression of Caspase-3.

panax notoginseng saponis；U937 cells；apoptosis；Caspase-3

2013-12-23

2014-02-13

·臨床報道·