綠茶多酚對(duì)東莨菪堿及D-乳糖所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響

李 軍 辛 勤 林麗文

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067)

老年性癡呆，即阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)多發(fā)在老年，以近期記憶障礙為主要臨床癥狀，以神經(jīng)元纖維纏結(jié)、大量記憶性神經(jīng)元丟失以及β-淀粉樣蛋白沉積為主要病理改變的進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病，目前仍無(wú)良好的防治藥物[1-2]。綠茶是一種非發(fā)酵茶，其主要活性成分是綠茶多酚(green tea polyphenols，GTPs)[3]。GTPs是綠茶中酚類物質(zhì)的總稱，其中兒茶素類含量最多，近年研究發(fā)現(xiàn)GTPs具有抗氧化、 減輕自由基損傷、抗衰老、抗炎、抗菌、抗癌等多種藥理作用[4]。本實(shí)驗(yàn)以東莨菪堿和D-半乳糖建立記憶障礙小鼠模型，觀察GTPs對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雄性，體重(20±2.0)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2藥物與試劑 GTPs(鄭州荔諾生物科技有限公司，批號(hào)：CDF20120302);吡拉西坦(吉林雙藥藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20111001);氫溴酸東莨菪堿(上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：110402);生理鹽水(石家莊四藥有限公司，批號(hào)：110824405);D-半乳糖(上海源聚生物科技有限公司，批號(hào)：101201)。

1.1.3主要儀器設(shè)備 小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀(成都泰盟科技有限公司，ZZ-6型)；小鼠跳臺(tái)測(cè)試儀(成都泰盟科技有限公司，DT-200型)；程控水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，SMG-2型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥 首先將小鼠在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)7d以適應(yīng)環(huán)境，然后進(jìn)行預(yù)選，即將小鼠放入跳臺(tái)裝置，加以24V電壓，將過(guò)度敏感(通電立刻出現(xiàn)電驚厥)小鼠和極不敏感(不表現(xiàn)逃避電擊反應(yīng))小鼠淘汰，篩選出60只合格小鼠。隨機(jī)分為6組(每組10只)：1)正常對(duì)照組；2)模型組；3)陽(yáng)性對(duì)照組(吡拉西坦)；4)GTPs低劑量組；5)GTPs中劑量組；6)GTPs高劑量組。各組均按0.1ml/10g體重灌胃給藥，每日1次。1)、2)組灌胃0.9%生理鹽水；3)組灌胃吡拉西坦600mg/kg；4)組灌胃GTPs 100mg/kg；5)組灌胃GTPs 250mg/kg；6)組灌胃GTPs 625mg/kg[5]。

1.2.2東莨菪堿致小鼠記憶獲得障礙實(shí)驗(yàn) 按上述方法分組并連續(xù)給藥14d，末次灌胃給藥后2h，除1)組灌胃等容積的生理鹽水外，2)～6)組分別按2mg/kg腹腔注射東莨菪堿(造模)，注射后30min，進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，24h后進(jìn)行測(cè)試。第17天開始進(jìn)行水迷宮行為實(shí)驗(yàn)，第17至第19天訓(xùn)練，第20天測(cè)試且數(shù)據(jù)作為記憶成績(jī)。

1.2.3D-半乳糖致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙實(shí)驗(yàn) 按上述方法分組，除1)組外；2)～ 6)組每日頸背部皮下注射140mg/kg·d D-半乳糖，連續(xù)6周，造成學(xué)習(xí)記憶障礙的模型小鼠。同時(shí)，1)組和2)組灌胃等體積生理鹽水，其余4組灌胃相應(yīng)藥物，給藥體積均為0.1ml/10g，連續(xù)42d。末次給藥后1h進(jìn)行跳臺(tái)訓(xùn)練，第43天進(jìn)行測(cè)試且數(shù)據(jù)作為記憶成績(jī)。第45至第47天進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，第48天測(cè)試且數(shù)據(jù)作為記憶成績(jī)。

1.2.4跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)(step-down test)[6]實(shí)驗(yàn)時(shí)先將小鼠放入跳臺(tái)箱中適應(yīng)環(huán)境3min，隨后將其放在安全平臺(tái)上并通以24V交流電，如小鼠跳下平臺(tái)，正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)以躲避傷害性刺激。但多數(shù)動(dòng)物可能再次或多次跳下平臺(tái)，受到電擊后又跳回平臺(tái)。以小鼠跳下平臺(tái)雙足接觸銅柵記為錯(cuò)誤次數(shù)，如此訓(xùn)練5min。24h后進(jìn)行測(cè)試，直接將小鼠放在安全平臺(tái)上并通電，記錄5min內(nèi)小鼠首次跳下平臺(tái)的時(shí)間(即潛伏期)和跳下平臺(tái)受電擊的次數(shù)(即錯(cuò)誤次數(shù))，作為記憶成績(jī)。測(cè)試時(shí)若小鼠停留在平臺(tái)上超過(guò)5min，則其潛伏期記為300s。

1.2.5水迷宮實(shí)驗(yàn)(water maze test)[7]實(shí)驗(yàn)開始后將小鼠頭朝迷宮壁放在起點(diǎn)，記錄小鼠從起點(diǎn)游至終點(diǎn)的時(shí)間(潛伏期)及進(jìn)入迷宮盲端的錯(cuò)誤次數(shù)，3min內(nèi)游不出者潛伏期記為180s。若小鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)不能游至臺(tái)階，則將其引導(dǎo)至臺(tái)階，并使其在終點(diǎn)停留20s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 東莨菪堿致獲得記憶障礙小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠在跳臺(tái)試驗(yàn)中的錯(cuò)誤次數(shù)增多(P<0.05)，潛伏期明顯縮短(P<0.01)。與模型組相比，GTPs中、高劑量組對(duì)東莨菪堿所致小鼠記憶獲得障礙有明顯改善作用，表現(xiàn)為5min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)減少(P<0.05)，潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，而且與吡拉西坦組比較無(wú)差異。結(jié)果見(jiàn)表1

表1 GTPs對(duì)東莨菪堿致記憶獲得障礙小鼠跳臺(tái)成績(jī)的影響

注：與正常對(duì)照組比較，#P<0.05，# #P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 東莨菪堿致獲得記憶障礙小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠進(jìn)入盲端次數(shù)(即錯(cuò)誤次數(shù))明顯增多(P<0.01)，到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間(潛伏期)明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。綠茶多酚低、中、高劑量組均使小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)減少(P<0.05)，潛伏期縮短(P<0.05)。而且綠茶多酚各劑量組與吡拉西坦組之間無(wú)差異。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 GTPs對(duì)東莨菪堿造成記憶獲得障礙小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

注：與正常對(duì)照組比較，#P<0.05，# #P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 D-半乳糖致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠首次錯(cuò)誤的潛伏期明顯縮短(P<0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)增加(P<0.05)。GTPs低、中、高劑量組小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)較模型組減少(P<0.05)，潛伏期較模型組明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。而且與吡拉西坦組比較無(wú)差異。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 GTPs對(duì)D-半乳糖致記憶獲得障礙小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)成績(jī)的影響

注：與正常對(duì)照組比較，#P<0.05，# #P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 D-半乳糖致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠進(jìn)入迷宮盲端的錯(cuò)誤次數(shù)增多(P<0.05)，到達(dá)終點(diǎn)的潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。GTPs低、中、高劑量組小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)較模型組減少(P<0.05)，潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.01)。而且與吡拉西坦組比較無(wú)差異。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 GTPs對(duì)D-半乳糖致記憶獲得障礙小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

注：與正常對(duì)照組比較，#P<0.05，# #P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

學(xué)習(xí)、記憶和思維是大腦的高級(jí)活動(dòng)，記憶障礙AD的重要癥狀?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，乙酰膽堿(Ach)為腦內(nèi)促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì)，東莨菪堿是中樞M型膽堿受體拮抗劑，能特異性阻滯信息由第一級(jí)記憶向第二級(jí)記憶的轉(zhuǎn)移過(guò)程，干擾獲得近期記憶的能力，從而造成記憶獲得障礙?，F(xiàn)已廣泛用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中建立認(rèn)知功能損傷的動(dòng)物模型。本研究給小鼠一次腹腔注射東莨菪堿2mg/kg，造成小鼠記憶獲得障礙。

本研究還采用了長(zhǎng)期頸部皮下注射D-半乳糖的方法建立具有記憶功能障礙的小鼠模型。在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)給小鼠注射D-半乳糖，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度逐漸升高，在醛糖還原酶催化下還原成半乳糖醇，半乳糖醇這種代謝終產(chǎn)物不能進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙及全身代謝紊亂，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老，這一過(guò)程與機(jī)體的自然衰老過(guò)程相似[8]，同時(shí)大量的D-半乳糖在半乳糖氧化酶的作用可產(chǎn)生過(guò)量的超氧陰離子自由基(O2-)，與核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子反應(yīng)，損壞機(jī)體的功能，加重對(duì)細(xì)胞的損傷，短期內(nèi)可引起小鼠衰老甚至死亡[9]。D-半乳糖致小鼠衰老模型是目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用最多的衰老模型。

藥物對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響，主要是通過(guò)行為學(xué)的方法來(lái)觀察，本文采用了2種不同的行為學(xué)測(cè)定實(shí)驗(yàn)來(lái)反映衰老過(guò)程中小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，其中跳臺(tái)法反映小鼠的被動(dòng)回避能力，水迷宮法反映小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力；這2個(gè)行為學(xué)指標(biāo)均可客觀地反映出各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力情況。

本文結(jié)果表明，腹腔注射東莨菪堿的小鼠出現(xiàn)了明顯的記憶障礙，GTPs 中、高劑量能明顯改善小鼠在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的記憶再現(xiàn)缺失，使小鼠的跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)減少，潛伏期明顯延長(zhǎng)；GTPs各劑量組能拮抗小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的空間定向?qū)W習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為從起點(diǎn)到達(dá)終點(diǎn)平臺(tái)的潛伏期縮短，進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)減少，明顯提高學(xué)習(xí)的記憶能力。本文結(jié)果還表明，D-半乳糖模型組小鼠也出現(xiàn)了明顯的記憶障礙，GTPs各劑量組可明顯改善D-半乳糖引起的小鼠記憶減退，且具有一定的劑量依賴性。

綜上所述，本文采用2種比較成熟的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，采用2種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，證明GTPs能較好改善記憶獲得障礙模型小鼠的記憶功能。GTPs對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用可能與其抗氧化、增強(qiáng)對(duì)自由基的清除、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞免受自由基的損害作用有關(guān)，其具體作用機(jī)理正在研究中。

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