以PECAM-1為標(biāo)志去除殘留未分化胚胎干細(xì)胞的研究

王玲唐 鄭 雅 付 煒 張文杰

·論著·

以PECAM-1為標(biāo)志去除殘留未分化胚胎干細(xì)胞的研究

王玲唐 鄭 雅 付 煒 張文杰

目的以血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）為標(biāo)志，去除小鼠胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ESCs）中殘留未分化的細(xì)胞，以去除其致瘤性，為ESCs在研究中的安全應(yīng)用提供思路。方法將小鼠R1胚胎干細(xì)胞株在撤去白血病抑制因子的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)6 d，體外自發(fā)分化形成類胚體，消化打散后，以PECAM-1為標(biāo)志進(jìn)行磁珠分選，得到陽性與陰性細(xì)胞群體，分別以2×106個(gè)/點(diǎn)注射入裸鼠背部皮下，6～8周后觀察畸胎瘤形成情況，組織學(xué)分析瘤體構(gòu)成。結(jié)果裸鼠背部成瘤結(jié)果顯示，PECAM-1+細(xì)胞群注射8個(gè)點(diǎn)中7個(gè)成瘤，成瘤率87.5%；而PECAM-1-細(xì)胞群注射8個(gè)點(diǎn)中1個(gè)成瘤，成瘤率12.5%。PECAM-1+細(xì)胞群與PECAM-1-細(xì)胞群成瘤率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.01）。結(jié)論應(yīng)用PECAM-1可去除體外分化過程中的殘留未分化ESCs，并去除其致瘤性。

胚胎干細(xì)胞殘留血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1

胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有自我更新和無限增殖能力，可分化為生物體所有的細(xì)胞類型，在細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用前景，而致瘤性仍然是ESCs未來臨床應(yīng)用中面臨的重大問題。研究證實(shí)，即使極少量的ESCs植入裸鼠體內(nèi)也會(huì)導(dǎo)致畸胎瘤的產(chǎn)生，并且將ESCs體外分化后高純度分選移植裸鼠體內(nèi)，也不能避免畸胎瘤的產(chǎn)生[1-3]。有研究認(rèn)為，畸胎瘤的形成是由于ESCs體外誘導(dǎo)分化過程中，殘留有未分化的ESCs所致；ESCs分化殘留的產(chǎn)生是細(xì)胞培養(yǎng)過程中染色體突變?cè)斐傻腫4]。我們的前期研究證實(shí)，ESCs體外分化殘留是ESCs的固有特性[5]。許多研究都致力于去除殘留未分化的胚胎干細(xì)胞，如引入自殺基因[6-8]、腫瘤抑制基因干擾[9-10]，利用細(xì)胞毒性抗體[11]或多能干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物[12]。以階段特異性胚胎抗原-5（Stage-specific embryonic antigen-5，SSEA-5）為標(biāo)志物，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)，可去除人胚胎干細(xì)胞中殘留未分化的細(xì)胞，降低畸胎瘤形成率。SSEA-1是比較公認(rèn)的小鼠未分化胚胎干細(xì)胞的表面標(biāo)志物[1]，認(rèn)為PECAM-1+/SSEA-1+細(xì)胞可能是殘留未分化的胚胎干細(xì)胞[13]。我們?cè)谇捌谘芯恐?，將畸胎瘤組織中SSEA-1陽性與陰性細(xì)胞分選后，給予胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)SSEA-1陽性與陰性細(xì)胞均有克隆產(chǎn)生，提示SSEA-1可能并非理想的去除殘留未分化細(xì)胞的標(biāo)志。本研究以PECAM-1為標(biāo)志，探討應(yīng)用PECAM-1去除殘留未分化細(xì)胞的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠R1胚胎干細(xì)胞系由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所贈(zèng)送。

雄性BALB/c裸鼠16只，6周齡，體質(zhì)量約20 g。動(dòng)物購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2007-0005，使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2007-0007。

高糖DMEM、15%FBS（Invitrogen公司，美國）；I MEM（Gibco公司，美國）；2 mmol/L L-谷氨酰胺、10 ng/mL絲裂霉素、50 μmol/L 1-硫代甘油（Sigma公司，美國）；10 ng/mL重組人LIF（Chemicon公司，美國）；生物素結(jié)合的大鼠抗小鼠CD31抗體、Streptavidin-PE/Cy5（BD Pharmingen公司，美國）；抗生物素MACS微珠、MASC（Miltenyi公司，德國）；FASC（Beckman公司，美國）。

1.2 ESCs培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

ESCs常規(guī)培養(yǎng)液為高糖DMEM、15%FBS、50 μmol/L MTG、2 mmol/L L-谷氨酰胺和10 ng/mL重組人LIF。10 ng/mL絲裂霉素處理后的MEFs作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。

1.2.2 誘導(dǎo)分化

ESCs分化前，先在0.1%明膠上傳1代；0.25%胰蛋白酶消化后，接種于培養(yǎng)皿，細(xì)胞濃度為（2～5）×104cells/mL。每個(gè)培養(yǎng)皿添加10 mL培養(yǎng)液。類胚體分化培養(yǎng)液為IMEM、15%FBS、50 μmol/L MTG、50 μg/mL抗壞血酸（Vit C）和2 mmol/L L-谷氨酰胺。培養(yǎng)液每3天半量換液。

1.3 磁珠分選和流式細(xì)胞儀純度分析

1.3.1 磁珠分選

分離第6天類胚體中PECAM-1陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞群體。收獲第6天類胚體細(xì)胞，消化為單細(xì)胞，以1×106cells/mL重懸于含0.5%胎牛血清的PBS中，加入抗生物素結(jié)合的大鼠抗小鼠CD31抗體（1∶200），克隆號(hào)為13.3，4℃孵育30 min。PBS漂洗3次后，以1.25×108cells/mL重懸于含加入0.5%胎牛血清的PBS中，加入抗生物素MACS微珠（1∶4），4℃孵育15 min，加入PBS，300 g漂洗10 min后，上機(jī)進(jìn)行兩次陰性選擇，得到PECAM-1陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞群。

1.3.2 流式細(xì)胞儀分析

檢測磁珠分選后PECAM-1陽性和陰性細(xì)胞群體純度。取磁珠分選所得部分細(xì)胞，以1×106cells/mL重懸于含4%胎牛血清的PBS中，分別加抗生物素結(jié)合的大鼠抗小鼠CD31抗體（1∶200），克隆號(hào)為390，4℃孵育3 min。PBS漂洗3次后，加Streptavidin-PE/Cy5（1∶1 000），4℃暗處孵育30 min，PBS漂洗3次后，上機(jī)檢測，結(jié)果用Flowjo軟件分析。

1.4 畸胎瘤實(shí)驗(yàn)

檢測磁珠分選所得兩群細(xì)胞體內(nèi)分化形成畸胎瘤的能力差異。將磁珠分選所得兩群細(xì)胞分別懸浮在含10%血清的DMEM中，將2×106個(gè)細(xì)胞（0.2 mL）注射至BALB/c裸鼠側(cè)背部皮下，左側(cè)為PECAM-1+細(xì)胞群，右側(cè)為PECAM-1-細(xì)胞群，左右各8個(gè)點(diǎn)位。6周后注射部位取材，觀察瘤體形成情況。瘤體標(biāo)本4%多聚甲醛固定、石蠟包埋切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察瘤體組織構(gòu)成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCs體外分化為EBs

正常傳代培養(yǎng)的ESCs呈緊密的巢狀克隆樣生長，邊緣光整（圖1A）。將ESCs經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化打散后，以（2～5）×104cells/mL的細(xì)胞量接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿，細(xì)胞在撤去LIF的培養(yǎng)基中呈懸浮生長，聚集成球，形成EBs（圖1B）。球體邊緣規(guī)整，透亮。

圖1 R1-ESCs體外分化（標(biāo)尺：100 μm）Fig.1 The differentiation of R1-ESCs cells (Scale bars:100 μm)

2.2 磁珠分選所得細(xì)胞純度分析

第6天EBs中PECAM-1的表達(dá)量為25.6%左右（圖2A）。為進(jìn)一步明確經(jīng)MACS分選的PECAM-1+和PECAM-1-細(xì)胞群的純度，運(yùn)用流式細(xì)胞分析儀分別對(duì)其進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果用Flowjo軟件進(jìn)行分析。分選得到的PECAM-1+細(xì)胞群中純度約為63.6%（圖2B），而PECAM-1-細(xì)胞群純度約為94.4%，其中仍然含有5.6%PECAM-1+細(xì)胞（圖2C）。

圖2 PECAM-1+和PECAM-1-細(xì)胞純度分析Fig.2 Purity of PECAM-1+cells and PECAM-1-cells

2.3 畸胎瘤形成及結(jié)果統(tǒng)計(jì)

為檢測PECAM-1是否可作為理想的剔除致瘤細(xì)胞的標(biāo)志，達(dá)到在ESCs分化環(huán)境中去除其致瘤性的目的，將分選得到的PECAM-1+和PECAM-1-細(xì)胞按相同細(xì)胞量2×106個(gè)/點(diǎn)分別注射入裸鼠背部皮下（圖3A），6～8周后觀察畸胎瘤形成情況（圖3B）。將畸胎瘤形成情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)PECAM-1+細(xì)胞群注射8個(gè)點(diǎn)中7個(gè)成瘤，成瘤率87.5%；而PECAM-1-細(xì)胞群注射8個(gè)點(diǎn)中1個(gè)成瘤，成瘤率12.5%。PECAM-1+細(xì)胞群與PECAM-1-細(xì)胞群成瘤率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.01）。

圖3 PECAM-1+和PECAM-1-細(xì)胞畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)Fig.3 The teratomas formation by PECAM-1+cells and PECAM-1-cells in vivo

2.4 畸胎瘤HE染色

注射后6～8周，PECAM-1+細(xì)胞與PECAM-1-細(xì)胞注射部位均有畸胎瘤形成，PECAM-1+細(xì)胞所形成畸胎瘤與PECAM-1-細(xì)胞所形成的畸胎瘤大小無明顯差異（圖4A）。HE染色顯示，PECAM-1+細(xì)胞與PECAM-1-細(xì)胞所成畸胎瘤瘤體中，均存在成熟的內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織（圖4B、C）。

圖4 PECAM-1-和PECAM-1+細(xì)胞形成畸胎瘤組織學(xué)分析Fig.4 Histological observation of teratomas formation by PECAM-1-cells and PECAM-1+cells

3 討論

胚胎干細(xì)胞的致瘤性風(fēng)險(xiǎn)仍然是制約其臨床應(yīng)用的最核心問題。其致瘤的原因，有研究認(rèn)為與胚胎干細(xì)胞體外分化過程中殘留的未分化干細(xì)胞有關(guān)。如何有效去除殘留的未分化細(xì)胞成為了研究的熱點(diǎn)問題。通常采用兩種方法：一種以目的細(xì)胞為焦點(diǎn)，選擇目的細(xì)胞特異性標(biāo)記陽性的細(xì)胞，去除其他類型細(xì)胞；一種以殘留干細(xì)胞為靶點(diǎn)，選擇干細(xì)胞特異性標(biāo)記，去除殘留干細(xì)胞，保留所有其他類型細(xì)胞。兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)，前者目標(biāo)細(xì)胞明確，但細(xì)胞類型單一，可能遺漏其他在移植中具有輔助功能的細(xì)胞；后者包含不同分化階段的細(xì)胞，移植效果可能更好，但必須找到合適的分化殘留細(xì)胞標(biāo)記。

殘留未分化細(xì)胞標(biāo)志物的選擇從已知的胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物著手，PECAM-1和SSEA-1是小鼠胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，SSEA-1并不是合適的去除殘留細(xì)胞的標(biāo)志物（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。因此，本研究著重探討PECAM-1這一細(xì)胞表面標(biāo)志。文獻(xiàn)報(bào)道，PECAM-1不僅在成體組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞和造血系統(tǒng)的細(xì)胞上表達(dá)，同時(shí)也在鼠類胚胎干細(xì)胞的分化過程中及早期小鼠胚胎中表達(dá)，且未分化的胚胎干細(xì)胞也表達(dá)PECAM-1[13-19]。Yue等[13]對(duì)PECAM-1的表達(dá)量進(jìn)行了基因水平和蛋白表達(dá)水平的研究，發(fā)現(xiàn)PECAM-1在ESCs中高表達(dá)，在體外分化早期1～2 d內(nèi)表達(dá)迅速降低，5～6 d后逐漸回升，前期降低與ESCs分化有關(guān)，后期升高與血液和內(nèi)皮細(xì)胞分化形成有關(guān)，在晚期20 d的EBs中依然有部分細(xì)胞共表達(dá)PECAM-1和SSEA-1，提示了這部分細(xì)胞很可能就是殘留未分化的細(xì)胞。因此，我們選取了PECAM-1作為標(biāo)志開展了本研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，致瘤細(xì)胞在PECAM-1+細(xì)胞群中富集，成瘤率高，但在PECAM-1-細(xì)胞群中也有個(gè)別畸胎瘤的產(chǎn)生，其原因很可能是由于細(xì)胞分選的純度低而引起的。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，分選后的細(xì)胞中PECAM-1+細(xì)胞的純度達(dá)60%以上，但即使混有40%左右的陰性細(xì)胞，也不會(huì)影響其形成畸胎瘤。而在PECAM-1-細(xì)胞群中，即使純度達(dá)95%，但仍有5%左右的陽性細(xì)胞混在其中，這些混雜的細(xì)胞足以形成畸胎瘤。從陽性和陰性細(xì)胞的成瘤率統(tǒng)計(jì)分析可以看到兩者有顯著差異，提示了以PECAM-1為殘留細(xì)胞標(biāo)志物的可行性，但細(xì)胞分選技術(shù)有待提高。通常磁珠分選的純度相對(duì)較低，如果要得到高純度的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選的效果更佳，但同時(shí)會(huì)面臨分選時(shí)間長、對(duì)細(xì)胞損傷大等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)明確了可以PECAM-1為殘留細(xì)胞的標(biāo)志，以此為標(biāo)的的靶向性清除（包括分選、藥物殺傷等）技術(shù)的開發(fā)，有望為解決分化殘留細(xì)胞導(dǎo)致的致瘤性問題提供可行的方案。

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Removal of Ofteratoma-forming Cells from Differentiated Embryonic Stem Cells Based on PECAM-1 Expression

WANG Ling,TANG Zhengya,FU wei,ZHANG Wenjie.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering, Shanghai Stem Cell Institute,Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241, China.Corresponding author:ZHANG Wenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

ObjectiveTo prevent teratoma formation by removal of the residual undifferentiated cells from differentiated mouse embryonic stem cells(mESCs)based on PECAM-1 expression,to hopefully promote the safe use of ESCs-based treatment in future.MethodsMouse R1 ESCs were cultured in suspension to form embryoid bodies(EBs)in the absence of leukemia inhibitory factor for 6 days.EBs were then digested into single cells and sorted by magnetic activated cell sorting (MACS)based on PECAM-1 expression.Total of 2×106PECAM-1+and PECAM-1-cells were injected subcutaneously into nude mice respectively.Teratoma formation was measured after 6-8 weeks.ResultsSeven out of 8 injected points formed teratoma in the PECAM-1+cells after 8 weeks of injection,with a tumor formation rate of 87.5%.While only 1 out of 8 injected points formed teratoma in the PECAM-1-cells,with a tumor formation rate of 12.5%.A significantly difference was observed between PECAM-1 positive and negative cells(P=0.01).ConclusionPECAM-1 is a specific marker for residual cells,which could be utilized to remove residual undifferentiated ESCs from in vitro differentiated ESCs,and eventually solve the tumorigenicity problem of ESCs.

Embryonic stem cells;Residual;Platelet endothelial cell adhesion molecule-1

Q813.1+1

A

1673－0364（2014）06－0301－04

2014年9月2日；

2014年10月15日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.001

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（“973”項(xiàng)目，2011CB964704）；國家自然科學(xué)基金（81271714，31170944）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；200241上海市組織工程國家工程研究中心。

張文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。