TNF-α-308基因多態(tài)性與強(qiáng)迫癥的易感性研究

高玉峰 ，邱海棠 ，王 帆，張向陽(yáng)，傅一笑，羅慶華，杜 蓮，邱 田，蒙華慶△

(1.廣東省中山市第三人民醫(yī)院二科 528451；2．重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心理衛(wèi)生中心 400016；3．北京回龍觀醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 100096)

強(qiáng)迫癥(obsessive-compulsive disorder，OCD)是以強(qiáng)迫觀念，強(qiáng)迫意向，強(qiáng)迫行為為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)癥。普通人群患病率1.1%～3.3%。OCD的病因至今未明，但已有研究顯示強(qiáng)迫癥具有家族遺傳聚集性，患者家屬中OCD及亞臨床OCD患病率較普通人群高10%～20%[1]。5-HT類基因是OCD的候選基因，然而已有的研究顯示5-HT對(duì)OCD易感性的影響結(jié)論不一，使得研究人員不得不進(jìn)一步尋找除此之外的其他影響因素[2-3]。Marazziti等[4]研究發(fā)現(xiàn)，OCD患者較健康人CD8(TS細(xì)胞)明顯增多，CD4(Th細(xì)胞)明顯減少。Barber等[5]研究也發(fā)現(xiàn)，男性O(shè)CD患者的自然殺傷(NK)細(xì)胞升高，都提示OCD患者的免疫系統(tǒng)也發(fā)生了改變。編碼人腫瘤壞死因子α(TNF-α)的基因定位于6號(hào)染色體短臂上，位于MHC-Ⅲ區(qū)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有高度的基因多態(tài)性。其多態(tài)性表現(xiàn)為兩個(gè)不同的等位基因形式：將-308位是鳥(niǎo)嘌呤(G)的等位基因定義為常見(jiàn)型TNF1/1，為腺嘌呤(A)時(shí)定義為稀少型TNF2，即TNF-308位G被A替換，形成TNF2等位基因形式(包括TNF2/2和TNF1/2)[6]。研究表明，TNF2可以提高TNF-α轉(zhuǎn)錄活性而增加TNF-α的產(chǎn)生[7]。多項(xiàng)研究都顯示，TNF2等位基因與一系列感染性疾病及自身免疫性疾病有關(guān)[8-9]。本研究通過(guò)比較分析TNF-α-308基因型在OCD組及健康對(duì)照組中的分布，探討其基因多態(tài)性與OCD易感性的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2008年2月至2008年6月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院精神科門診就診及北京回龍觀醫(yī)院住院的26例OCD患者(OCD組)。其中男12例，平均(32.12±5.39)歲，起病年齡(18.27±4.94)歲，平均病程(5.32±1.74)年；女14例，平均(30.29±6.36)歲，起病年齡(19.36±5.19)歲，平均病程(6.4±2.95)年。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中國(guó)精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)第3版(CCMD-3)中OCD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)無(wú)器質(zhì)性疾??；(3)年齡在18～65歲；(4)均為漢族。收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心的14例健康體檢人員及志愿者(健康對(duì)照組)。其中，男7例，平均(30.27±5.78)歲；女7例，平均(34.29±7.29)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～65歲；無(wú)重大軀體疾病，無(wú)任何符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的精神疾病；既往無(wú)精神疾病史，無(wú)精神疾病家族史，所有研究對(duì)象均無(wú)血緣關(guān)系。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集 抽取肘靜脈血2 mL置于含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的試管中，輕輕搖勻后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)。

1.2.2DNA提取 采用Promega生物工程有限公司基因組DNA提取試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.2.3PCR擴(kuò)增 TNF-α基因啟動(dòng)子-308位點(diǎn)引物(引物由北京生工合成)FW：5-′GAG GCA ATA GGT TTT GAG GGC CAT;RV:GGG ACA CAC AAG CAT CAA G-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為147 bp。PCR反應(yīng)體系:總體積10 μL,含引物(各5 pmol/μL)0.6 μL,10×PCR緩沖液1 μL,DNA(模板)2 μL，taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(d NTP) 0.2 μL，三蒸水5.2 μL。采用熱循環(huán)儀，95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s,59 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；最后72 ℃ 5 min末次延伸。

1.2.4酶切及電泳 酶切體系總體積10 μL，含PCR擴(kuò)增產(chǎn)物9 μL，10×緩沖液0.7 μL,限制性內(nèi)切酶NcoⅠ 0.3 μL(10 U/μL,購(gòu)至MBI公司)，37 ℃過(guò)夜。將產(chǎn)物上樣于3%瓊脂糖膠，與標(biāo)準(zhǔn)DNA Maker同步電泳，恒定電壓120 V電泳50 min后分析結(jié)果。酶切后產(chǎn)生3種結(jié)果147 bp,147 bp 126 bp 21 bp,126 bp 21 bp,分別代表TNF-α1/1型(終產(chǎn)物為126 bp 1條帶，G等位基因純合子)； TNF-α1/2(終產(chǎn)物為147 bp、126 bp兩條帶，雜合子)，TNF-α2/2(終產(chǎn)物為147 bp 1條帶，A等位基因純合子)。由于21 bp的條帶長(zhǎng)度太小，在凝膠上無(wú)法分辨，故能夠觀測(cè)到的是147 bp和126 bp兩個(gè)條帶。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。將TNF-α-308基因型等位基因TNF-α1/1及1/2型以四格表進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)算比值比(OR)和95%CI，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PCR質(zhì)量控制結(jié)果 隨機(jī)抽取5例樣本，重復(fù)檢測(cè)基因型結(jié)果與前完全一致，證明本試驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.2TNF-α-308位基因多態(tài)性PCR結(jié)果 其中1泳道為TNF1純和基因型；2泳道為TNF2純和基因型；5泳道為TNF1/2雜合型，見(jiàn)圖1。

1、2、4：TNF-α1/1純合基因型；3：DNA Marker；5：TNF-α1/2雜合基因型。

圖1 TNF-α基因啟動(dòng)子-308位點(diǎn)3%瓊脂糖膠電泳圖

2.3兩組Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn) OCD組TNF-α基因型分布的觀察值和期望值吻合度良好，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；健康對(duì)照組TNF-α基因型分布的觀察值和期望值吻合度良好；均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則。

2.4OCD和健康人TNF-α基因檢測(cè)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域-308位點(diǎn)只發(fā)現(xiàn)TNF-α1/1型及TNF-α1/2型兩種基因型，未發(fā)現(xiàn)TNF-α2/2基因型。TNF的基因型在OCD組及健康對(duì)照組中分布均以1/1型純合子占優(yōu)勢(shì)，OCD組為16.7%(TNF1/2)和83.3%(TNF1/1)，而健康人中全為TNF1/1型。兩組之間的基因型頻率分布的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.73，P<0.01)。

2.5兩組TNF-α-308 位基因多態(tài)性與OCD的相關(guān)分析 OCD組與健康對(duì)照組的差異主要來(lái)自G等位基因，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，使其患OCD的危險(xiǎn)性提高了1.93倍。因此，等位基因G與OCD易感性存在正相關(guān)。

3 討 論

已有許多研究提示，免疫系統(tǒng)在包括抑郁、癡呆、精神分裂癥等精神疾病的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用，一些焦慮的疾病包括創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、驚恐障礙、社交恐懼和OCD患者[10-11]。人們很早就注意到免疫系統(tǒng)在精神疾病中的病理生理作用。近年來(lái)的研究表明，細(xì)胞因子特別是TNF-α參與了急、慢性神經(jīng)退行性變，并且與神經(jīng)遞質(zhì)尤其是兒茶酚胺系統(tǒng)的平衡有相互作用。TNF-α是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的一種細(xì)胞因子，不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒、細(xì)胞溶解、抑制增殖等作用，還影響多種正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。另外，TNF-α還是一種重要的炎性介質(zhì)，參與免疫病理反應(yīng)，在機(jī)體免疫-炎癥協(xié)調(diào)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中起重要作用，還通過(guò)迷走神經(jīng)對(duì)中樞產(chǎn)生直接和間接的影響[12]。

人類細(xì)胞因子基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)道了其啟動(dòng)子區(qū)的8個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，且一些SNP位點(diǎn)的等位基因與某些感染性和自身免疫性疾病相關(guān)[13]。TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域多態(tài)性分布是非隨機(jī)性的，而很可能與選擇性的功能表達(dá)相關(guān)[14]。有研究首先報(bào)道了TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)-308位點(diǎn)的雙等位基因多態(tài)性， -308位點(diǎn)的G-A突變?cè)诟呒铀魅朔N中出現(xiàn)頻率高，較早就已成為研究熱點(diǎn)[15-16]。Louis等[6]發(fā)現(xiàn)，用脂多糖刺激TNF-α-308-2等位基因攜帶者個(gè)體的血細(xì)胞與TNF-α-2等位基因相比較，能產(chǎn)生較多量的TNF-α，表明TNF-α-308-2等位基因攜帶者由于TNF-α誘導(dǎo)表達(dá)水平增高，可能增加相關(guān)疾病的易感性。雖然TNF-α對(duì)疾病具有重要意義，但-308位點(diǎn)G-A突變發(fā)生率相當(dāng)?shù)?。?jù)報(bào)道，在新西蘭，健康人群TNF-α基因該位點(diǎn)突變率發(fā)生率為5.3%[17]。筆者采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法對(duì)TNF-α基因多態(tài)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在OCD患者中點(diǎn)突變的發(fā)生率為16.7%，健康人中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變，可能與樣本量較小有關(guān)。OCD組TNF-α點(diǎn)突變顯著高于對(duì)照組，結(jié)果與Konuk等[18]的研究相似。而Monteleone等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，在血漿IL-1β及IL-6的水平與健康對(duì)照組都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著性差異，而OCD患者的TNF-α水平顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。

綜上所述，TNF-α等位基因可能與OCD的易感性相關(guān)， TNF-α的功能為基因頻率在臨床上可作為遺傳性標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于預(yù)防早期OCD的發(fā)展具有重要意義。但本研究沒(méi)有考慮其他細(xì)胞因子的多態(tài)性位點(diǎn)及其他危險(xiǎn)因素的影響，不能排除TNF-α-308位點(diǎn)與其他細(xì)胞因子的位點(diǎn)基因連鎖而成為OCD易感性相關(guān)的遺傳標(biāo)志，還有待于擴(kuò)大樣本進(jìn)行多因素分析。

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