微生物脂肪酶基因表達(dá)調(diào)控蛋白的研究技術(shù)進(jìn)展

張瑞

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074

微生物脂肪酶基因表達(dá)調(diào)控蛋白的研究技術(shù)進(jìn)展

張瑞

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074

脂肪酶生產(chǎn)成本較高，它的應(yīng)用受到一定限制，因此利用生物工程技術(shù)使得脂肪酶的生產(chǎn)水平得到提升是亟需解決的難題.認(rèn)識(shí)微生物脂肪酶基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律，有助于通過基因工程技術(shù)，高水平表達(dá)生產(chǎn)脂肪酶，而微生物脂肪酶基因表達(dá)調(diào)控蛋白研究技術(shù)的進(jìn)步?jīng)Q定著其成果的先進(jìn)性.縱覽近年微生物脂肪酶基因表達(dá)調(diào)控蛋白的研究技術(shù)，主要有電泳技術(shù)、圓二色譜、酶譜、DNA宏觀陣列技術(shù)、質(zhì)譜、分子對(duì)接等，并分析應(yīng)用此類研究技術(shù)的發(fā)展方向．發(fā)現(xiàn)與微生物細(xì)胞表達(dá)脂肪酶蛋白調(diào)控相關(guān)蛋白，就可以對(duì)微生物細(xì)胞表達(dá)脂肪酶的生產(chǎn)過程進(jìn)行調(diào)控操作，使得細(xì)胞的代謝過程向著有利于脂肪酶的生產(chǎn)的方向進(jìn)行.

電泳技術(shù)；圓二色譜；酶譜；DNA宏觀陣列技術(shù)；質(zhì)譜；分子對(duì)接

0 引言

脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3）即甘油三酰酯水解酶，其生物學(xué)活性是催化甘油酯水解生成甘油和脂肪酸，同時(shí)它也能夠催化酯合成和酯交換反應(yīng).20世紀(jì)初微生物脂肪酶被發(fā)現(xiàn)，其具有很多優(yōu)點(diǎn)，如資源豐富，底物特異性，規(guī)?；a(chǎn)容易，已經(jīng)成為商業(yè)化脂肪酶的主要品種.微生物脂肪酶應(yīng)用范圍很廣，從工業(yè)上作為洗滌劑的活性劑以及到如今在生物催化等，都表現(xiàn)出很大的潛力，已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注，尤其是生物催化劑可以滿足對(duì)工業(yè)需求的廣譜性而越來越受歡迎；此外，酯酶在農(nóng)業(yè)和化學(xué)工業(yè)中發(fā)揮著重要的作用［1］.

在短時(shí)間內(nèi)應(yīng)用傳統(tǒng)的誘變野生菌的方法篩選出具有高產(chǎn)量和高活性等特定性質(zhì)的脂肪酶高產(chǎn)菌株較為困難，而運(yùn)用生物工程方法可高效快速的實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量、酶活等方面的提高，滿足實(shí)際生產(chǎn)需要.可采用多種方法提高脂肪酶的表達(dá)和穩(wěn)定性，如分子伴侶與脂肪酶基因的共表達(dá)、分泌蛋白與脂肪酶基因的共表達(dá)等.此外，通過改造表達(dá)基因，如脂肪酶基因或分泌蛋白基因以提高脂肪酶產(chǎn)量、活性和穩(wěn)定性也有較多報(bào)道.

認(rèn)識(shí)微生物脂肪酶基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律，有助于通過基因工程技術(shù)高水平表達(dá)生產(chǎn)脂肪酶，而微生物脂肪酶基因表達(dá)調(diào)控蛋白研究技術(shù)的進(jìn)步?jīng)Q定其成果的先進(jìn)性.另一方面，脂肪酶蛋白的3D結(jié)構(gòu)圖均已解析，利用已知的脂肪酶結(jié)構(gòu)信息，通過分子設(shè)計(jì)、體外進(jìn)化等蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對(duì)脂肪酶的醇耐受性、轉(zhuǎn)酯活性、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中的水耐受性等性質(zhì)進(jìn)行改性，對(duì)于擴(kuò)大工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用，降低生產(chǎn)成本，具有積極的意義.

縱覽先前此類研究所用技術(shù)，主要有電泳技術(shù)、圓二色譜、酶譜、DNA-陣列技術(shù)、質(zhì)譜、分子對(duì)接等，并分析應(yīng)用此類研究技術(shù)的研究方向.

1 微生物脂肪酶基因表達(dá)調(diào)控蛋白的研究技術(shù)

1.1 電泳技術(shù)

1.1.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱SDSPAGE），用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸.聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)；一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，與連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率.在電泳時(shí)，蛋白質(zhì)能夠在正常狀態(tài)下，按照其分子量大小、形狀及其所帶的電荷量而呈梯度展開，其遷移率主要取決于它的相對(duì)分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無關(guān).

通過SDS-PAGE，細(xì)胞中的蛋白片段、細(xì)胞膜、細(xì)胞溶解物等被分離，還可比較同源或同樣相對(duì)分子量的蛋白，并確定蛋白的分子量大小范圍［2-8］.

1.1.2 雙向凝膠電泳近年來，經(jīng)過多方面改進(jìn)，雙向凝膠電泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱2D-PAGE）已成為研究蛋白質(zhì)組的最有使用價(jià)值的核心方法.2D-PAGE的工作機(jī)理為:第一向根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同而利用等電聚焦使其分離，第二向就根據(jù)分子量的大小用使用SDS-PAGE使其分離，使多種蛋白混合物在二維平面上展開.電泳后，用圖像掃描儀、萊賽密度儀、電荷組合等裝置把蛋白質(zhì)圖譜數(shù)字化，再經(jīng)計(jì)算機(jī)利用相關(guān)軟件對(duì)對(duì)電泳圖象進(jìn)行分析處理，確定所有蛋白斑點(diǎn)的準(zhǔn)確位置和強(qiáng)度，得到蛋白斑點(diǎn)圖像，即“蛋白質(zhì)圖譜”.

利用2D-PAGE分離出來的蛋白及其圖譜，可進(jìn)行定性和定量的分析，此方法中微量的蛋白也可被鑒定.軟件分析分析蛋白質(zhì)圖譜，或蛋白免疫印跡法探究各類微生物表達(dá)蛋白的差異，得出能影響脂肪酶基因表達(dá)的蛋白類別.因此可分離蛋白質(zhì)組所有蛋白質(zhì)，只要通過差異分析或其它方法找到需要的蛋白后，就可以切取這些目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析［9-15］.

1.1.3 Northern雜交Northern雜交（Northern blotting）是研究基因表達(dá)中使用最廣泛的技術(shù)之一，其基本原理是，DNA能與RNA進(jìn)行分子雜交，在變性條件下，在尼龍或硝化纖維膜的固定載體上，使用標(biāo)記探針，檢測(cè)特異性RNA，這個(gè)探針DNA或RNA可放射性或非放射性標(biāo)記，進(jìn)行放射性自顯影，最后根據(jù)結(jié)果對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定性或定量.該技術(shù)應(yīng)用于特定性狀基因在mRNA水平上的動(dòng)態(tài)表達(dá)研究，通過使用放射性互補(bǔ)探針，鑒定特定的信使RNA分子組件.如信使核糖核酸由于大小不同，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后使用反義探針來確定凝膠的mRNA的種類［16］.

1.1.4 Southern印跡雜交Southern印跡雜交（Southern blotting）是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法，即在一定的條件下，兩條具某種程度上同源性的核酸單鏈，按堿基互補(bǔ)的原則可特異性地雜交而形成雙鏈.一般是先經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化DNA片段，再經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳將之分離，然后將DNA變性，并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)至尼龍膜或其他固相支持物上，干烤或紫外線照射固定后，再與相應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，達(dá)到檢測(cè)特定DNA分子的含量的目的.

由于核酸分子具有高度特異性，檢測(cè)方法的靈敏性也強(qiáng)，結(jié)合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析的數(shù)據(jù)，可繪制DNA分子的限制圖譜；應(yīng)用Southern印跡雜交技術(shù)，進(jìn)一步構(gòu)建出DNA分子的遺傳圖，或進(jìn)行目的基因序列的測(cè)定，可以滿足基因克隆的特殊要求，還能掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置.

Southern印跡法可進(jìn)行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中基因的定性或定量分析、基因突變分析等［13］.

1.1.5 免疫印跡法免疫印跡（Western blotting）是指的一種在聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝基或尼龍膜，并以抗體復(fù)合物確定具體的構(gòu)造的程序，與蛋白質(zhì)的特異性抗體結(jié)合后發(fā)現(xiàn)，與輔助蛋白質(zhì)生成一個(gè)為探測(cè)信號(hào)的標(biāo)簽.免疫印跡的方法通常是定量或定性地研究蛋白質(zhì)表達(dá)的一個(gè)選擇，它允許蛋白質(zhì)的檢測(cè)和特定的抗體在固相載體上（主要是硝基或PVDF膜）.檢測(cè)的信號(hào)可以通過使用放射性，染色底物，或者是化學(xué)發(fā)光底物，經(jīng)底物顯色或放射自顯影可檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分，能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的蛋白質(zhì)，也普遍用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá).采用免疫印跡檢測(cè)的固定在硝化纖維膜蛋白質(zhì)和其它大分子.這種快速和敏感的鑒定和量化特定的細(xì)胞溶解物中的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的混合物［2，5，10，13］.

1.2 圓二色譜

圓二色性（circular dichroism，簡(jiǎn)稱CD），可檢測(cè)手性對(duì)映體，立體異構(gòu)體具有圓二色性，不同的區(qū)段具有吸收右圓偏振光和左圓偏振光的特性；同時(shí)，某些類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如蛋白質(zhì)的α螺旋和β，表現(xiàn)出不同波長(zhǎng)的可預(yù)測(cè)的圓二色性摩爾吸光系數(shù)之間的差異為左旋和右旋，偏振光可觀察到分子手性對(duì)映體.這種對(duì)R和L兩種圓偏振光吸收程度的不同與波長(zhǎng)的變化關(guān)系性質(zhì)稱為圓二色譜，是一種測(cè)定分子不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的光譜法.圓二色性（CD）光譜學(xué)是一個(gè)獨(dú)特的光學(xué)技術(shù)，能夠檢測(cè)分子結(jié)構(gòu)的手性和估計(jì)其數(shù)量，并提供二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子的信息［3，17］.

1.3 酶譜

酶譜（Zymography）分析是一種廣泛使用的技術(shù)，研究基于蛋白質(zhì)底物降解的活動(dòng)的蛋白水解活動(dòng)，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離含有蛋白水解底物的蛋白質(zhì)，變性電泳后（不是非還原性的），蛋白質(zhì)是用在一個(gè)適當(dāng)?shù)木彌_液復(fù)性.酶是基因編碼的表達(dá)物，所以酶蛋白的肽鏈氨基酸的序列變化等性質(zhì)，通過分析酶譜可獲得，如同工酶是一個(gè)重要的分析工具，它是催化同一生化反應(yīng)，但運(yùn)動(dòng)性質(zhì)有所不同的同一種酶的不同表現(xiàn)形式，這是由于構(gòu)成蛋白質(zhì)亞基的氨基酸組成和順序有所不同而造成的.酶譜法是基于酶的底物全部水解酶檢測(cè)的電泳技術(shù)，通過對(duì)脂肪酶活性的檢測(cè)，可知鑒定和描述脂肪酶基因表達(dá)情形［7，9，18］.

1.4 DNA宏觀陣列技術(shù)

DNA macro-array是指點(diǎn)陣密集度較低的尼龍膜基因微陣列，膜及其上的每個(gè)點(diǎn)的面積相對(duì)較大，是固-液相雜交的模式，與常規(guī)的Southern雜交相似，根據(jù)探針標(biāo)記分子的種類等條件選擇檢測(cè)方法，如選擇同位素標(biāo)記.通過比較芯片上相同位置上的基因在不同樣品的雜交信號(hào)，就可以得到基因的表達(dá)信息，例如對(duì)蛋白分子在轉(zhuǎn)錄水平的超表達(dá)分析等.

根據(jù)影響脂肪酶基因表達(dá)的蛋白類別的基因序列，并用DNA陣列方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平，從轉(zhuǎn)錄水平分析脂肪酶基因調(diào)控蛋白.分別屏蔽影響脂肪酶基因表達(dá)的蛋白基因，檢測(cè)胞內(nèi)物質(zhì)和溢流代謝物質(zhì)和培養(yǎng)基中殘余底物的檢測(cè)，研究并證實(shí)影響脂肪酶基因表達(dá)的蛋白的作用以及這些蛋白之間互相作用的網(wǎng)絡(luò)［10］.

1.5 質(zhì)譜法

質(zhì)譜法（Mass Spectrometry）普遍用于各領(lǐng)域中通過制備、分離、檢測(cè)氣相離子而鑒定化合物的一種方法，是與光譜并列的譜學(xué)技術(shù)，當(dāng)前絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的鑒定是利用質(zhì)譜法進(jìn)行的.質(zhì)譜學(xué)方法是一種同時(shí)具備高特異性和高靈敏度、迅速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)的普適性方法.質(zhì)譜分析是一種測(cè)量離子質(zhì)荷比（質(zhì)量-電荷比）的分析方法，對(duì)于蛋白質(zhì)樣品，可以測(cè)定氨基酸序列，能進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析和翻譯后修飾分析，它能在一次分析中提供充分的結(jié)構(gòu)信息，因此生物質(zhì)譜已經(jīng)成為蛋白質(zhì)研究中分析與鑒定肽和蛋白質(zhì)的主要技術(shù)之一.

基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry，簡(jiǎn)寫為MALDI-MS）是20世紀(jì)80年代末出現(xiàn)并迅速發(fā)展和在科研中被廣泛應(yīng)用的分析技術(shù).其離子化方式產(chǎn)生的離子一般使用飛行時(shí)間（time of flight，TOF）檢測(cè)器測(cè)定，因此MALDI常與TOF一起被稱之為基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）.MALDI-TOF-MS技術(shù)，使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研究的質(zhì)譜技術(shù)能夠用于測(cè)定生物大分子，從而進(jìn)入生物質(zhì)譜分析技術(shù)時(shí)代.該技術(shù)使用“軟電離”方式，通常能產(chǎn)生穩(wěn)定分子離子，是測(cè)定生物大分子分子量的可靠方法，能用于生物化學(xué)分析，特別是在蛋白質(zhì)、核酸的定量分析研究中的大量應(yīng)用，如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等獲得定量數(shù)據(jù).［9，11，13，19，20］．

1.6 分子對(duì)接

分子對(duì)接（Molecular Docking）是一種對(duì)兩個(gè)或多個(gè)分子的幾何結(jié)構(gòu)的結(jié)合的計(jì)算機(jī)輔助預(yù)測(cè)模擬，可理論上模擬分子間結(jié)合的計(jì)算方法，分子可以借助計(jì)算機(jī)圖形學(xué)或通過使用計(jì)算機(jī)算法自動(dòng)結(jié)合，對(duì)接使用分子可視化軟件，手動(dòng)完成；可優(yōu)化受體化合物的位點(diǎn)，得到受體小分子化合物與靶標(biāo)大分子作用的最佳構(gòu)象，通過打分函數(shù)找出接近天然構(gòu)象的與受體親和力最佳的配體，從而模擬小分子配體與受體生物大分子相互作用的過程和結(jié)果，從而進(jìn)行分子之間結(jié)合的虛擬篩選.

在結(jié)合時(shí)，剛體和柔性對(duì)接過程，處理分子的靈活性和構(gòu)象變化，有各種各樣的算法自動(dòng)對(duì)接.分子對(duì)接的種類主要包括:剛體對(duì)接、半柔性對(duì)接、柔性對(duì)接.不同的算法通常用于對(duì)接兩個(gè)高分子相對(duì)于高分子和低分子量化合物的結(jié)合.通過分子對(duì)接可以選擇最適合的脂肪酶底物，也可奠定未來旨在研究脂肪酶在優(yōu)化化學(xué)活性和和立體選擇性的基礎(chǔ)［21］.

1.7 其他技術(shù)

還有一些常用的方法，如免疫檢測(cè)（immunodection）［6，10］，射線自顯跡法（autoradiography）［5，15］，自動(dòng)熒光攝影法（autofluorography）［15］，脈動(dòng)追蹤法（pulse-chase）［13］，生物信息學(xué)法［22］等，都是微生物脂肪酶基因表達(dá)調(diào)控蛋白研究上的利器.

2 展望

隨著分析檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，以及現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)生命活動(dòng)規(guī)律的探究和利用越來越深入徹底和高效合理.在利用微生物脂肪酶基因表達(dá)調(diào)控蛋白的研究中，通過對(duì)宿主和途徑的優(yōu)化，在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平直接控制生物合成途徑的通量，功能基因組學(xué)的方法非常適合于識(shí)別在生物合成途徑中的限速步驟，如利用目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)來研究調(diào)控脂肪酶表達(dá)的蛋白.通過2D-PAGE分離微生物細(xì)胞表達(dá)蛋白，研究脂肪酶野生型、過表達(dá)微生物表達(dá)蛋白與不表達(dá)脂肪酶基因菌株的表達(dá)蛋白的圖譜；利用相關(guān)蛋白圖譜軟件分析蛋白質(zhì)圖譜，或以蛋白免疫印跡（Western blotting）方法檢測(cè)電泳分離的特異性脂肪酶基因表達(dá)相關(guān)的蛋白成分，分析研究與微生物細(xì)胞外分泌脂肪酶蛋白調(diào)控相關(guān)蛋白，并確定此類蛋白的有關(guān)基因序列；研究與微生物細(xì)胞表達(dá)脂肪酶蛋白調(diào)控相關(guān)蛋白的調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)．找到了與微生物細(xì)胞表達(dá)脂肪酶蛋白調(diào)控相關(guān)蛋白，就可以對(duì)微生物細(xì)胞表達(dá)脂肪酶的生產(chǎn)過程進(jìn)行調(diào)控操作，使得細(xì)胞的代謝過程向著有利于脂肪酶的生產(chǎn)的方向進(jìn)行．

微生物分泌事件中有幾個(gè)瓶頸問題，例如瞄準(zhǔn)目標(biāo)轉(zhuǎn)移酶較難，分泌蛋白的降解和不正確的折疊等影響，然而分泌機(jī)制和途徑的研究將會(huì)改善微生物蛋白分泌系統(tǒng)和擴(kuò)大其作為工業(yè)生產(chǎn)菌的應(yīng)用前景．如今，許多微生物的完整基因序列已知，用現(xiàn)代技術(shù)廣泛地應(yīng)用于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，那些已存在的微生物生產(chǎn)菌株的優(yōu)化之路行進(jìn)得更遠(yuǎn)．盡管如此，每一個(gè)分泌蛋白是獨(dú)一無二的，對(duì)于生產(chǎn)表達(dá)系統(tǒng)而言需要進(jìn)行調(diào)整，如改變稀有密碼子優(yōu)化翻譯，但是以所有的關(guān)于啟動(dòng)子、質(zhì)粒、發(fā)酵、信號(hào)肽、分泌組織蛋白酶和分子伴侶以及突變株的收集等，使之更具有發(fā)展前景［10］．隨著發(fā)酵控制以及微生物表達(dá)調(diào)控技術(shù)的深入研究，脂肪酶的產(chǎn)量和品質(zhì)還將得到更大的提高，其成本也會(huì)越來越低，而在生產(chǎn)和生活中的應(yīng)用將越來越廣泛．

致謝

感謝華中科技大學(xué)生命與科學(xué)技術(shù)學(xué)院能源生物技術(shù)與生態(tài)學(xué)研究所在本論文撰寫過程提供的研究平臺(tái)！

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Technical development of regulation protein of expression of microbial lipase gene

ZHANG Rui
School of Chemical Engineering＆Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China

Owing to relatively high production costs of the present commercial lipases，the more practical application of lipase is restricted．Therefore，it is urgent to further enhance the productivity of lipase by bioengineering technology．Based on understanding the expression regulation mechanism and control law of microbial lipase gene，lipase high expression was achieved by using the strategy of genetic engineering technology．It’s well known that the progress of research technology on the microbial lipase gene expression regulation of protein is vital to advances of its achievements．Through overview of microbial lipase gene expression regulatory proteins in recent years，the main research techniques including the electrophoresis technology，circular dichroism，zymogram，DNA-array technology，mass spectrometry，and molecular docking applied to the regulation of microbial lipase are discussed．If regulation protein of expression of microbial lipase gene were found，the production process of microbial cells express lipase operation could be controlled，and the process of cell metabolism towards to the direction of lipase production could be made．

microbial lipase；electrophoresis technology；circular dichroism；zymogram；DNA-array technology；mass spectrometry；molecular docking

Q939.97

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2015.03.005

1674-2869（2015）03-0020-05

本文編輯：龔曉寧

2015-03-20

張瑞（1977-），男，湖北黃石人，實(shí)驗(yàn)師，博士研究生.研究方向:工業(yè)微生物.