活性污泥中主要微生物菌群研究進展

劉 松，閃 旭

（新疆旭日環(huán)保股份有限公司，烏魯木齊 830000）

活性污泥是活性污泥法處理污水系統(tǒng)的功能主體。20世紀80年代之前，活性污泥菌群的研究主要以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法為主，但培養(yǎng)的細菌數(shù)量只占活性污泥微生物總數(shù)的1%～15%。20世紀80年代后期，隨著以16SrRNA為主要基石的細菌分子分類學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)、電泳技術(shù)、克隆文庫技術(shù)、熒光原位雜交（FISH）和流式細胞術(shù)（FCM）等免培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)逐漸成為研究活性污泥菌群的主要手段，活性污泥中菌群的復(fù)雜性和多樣性也以驚人的速度被人們認識，大量傳統(tǒng)檢測方法未能發(fā)現(xiàn)卻在活性污泥中起關(guān)鍵作用的微生物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。為了深入了解免培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)的大量新的菌群的生理特性和作用機制，20世紀90年代后期，許多模擬活性污泥菌群生存環(huán)境的現(xiàn)代培養(yǎng)技術(shù)開始發(fā)展，且已成功培養(yǎng)了一部分傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)不能培養(yǎng)的新培養(yǎng)物，這無疑將把人們對活性污泥菌群的研究推向一個新的層次。

1 活性污泥法概述

1.1 活性污泥及活性污泥法

活性污泥是微生物群體及它們所依附的有機物質(zhì)和無機物質(zhì)的總稱。污水處理中，大多采用活性污泥法，而這種方法是通過微生物降解污水中的有機物質(zhì)，使污水得到凈化，是當前使用最廣泛的一種生物處理法。活性污泥法是將空氣連續(xù)鼓入曝氣池的污水中，經(jīng)過一段時間，水中即形成繁殖有巨量好氧微生物的絮凝體，即活性污泥，它吸附水中的有機物，生活在其上的微生物以有機物為食料，獲得能量并不斷生長增殖，有機物被去除，污水得到凈化。它不僅適用于生活污水的處理，且在紡織、印染、煉油、石油化工、造紙、焦化等許多工業(yè)廢水處理中，都取得了較好的凈化效果。

1.2 活性污泥法原理

活性污泥法是以活性污泥為主體的污水生物處理技術(shù)。其原理是通過充分曝氣供氧，使大量繁殖的生物群體懸浮在水中并利用從而降解污水中的有機污染物；停止曝氣時，懸浮微生物絮凝體易于沉淀與水分離，并使污水得到凈化、澄清。這種具有活性的絮凝體就是被稱為“活性污泥”的生物污泥。因此，要對污水生物處理技術(shù)作進一步研究，就必須深入了解活性污泥內(nèi)部的結(jié)構(gòu)原理。

2 活性污泥中的微生物菌群

活性污泥是由細菌、微型動物為主的微生物與懸浮物質(zhì)、膠體物質(zhì)混雜在一起所形成的茶褐色的絮凝體。其中的微生物主要由細菌組成，細菌主要有菌膠團細菌和絲狀菌，數(shù)量可占污泥中微生物總量的90%～95%，細菌在有機廢水的處理中起著最重要的作用。此外，活性污泥中還有原生動物和后生動物等微型動物。在處理生活污水的活性污泥中存在大量的原生動物和部分微型后生動物，通過辨別認定其種屬，據(jù)此可以判別處理水質(zhì)的優(yōu)劣，因此將微型動物稱為活性污泥系統(tǒng)中的指示生物。

活性污泥中微生物菌群具有高度多樣性，可分為6個主要的類群，其中，擬桿菌（Bacteroides）類群和γ變形菌（γ-Proteobacteria）類群所占比例最大，分別為38.03%和32.39%：其次是β- Proteobacteria，占19.72%；Firmicutes，Candidate division TM7和α-Proteobacteria類群所占比例相對較小，分別為4.23%，4.23%和1.04%。

2.1 動膠桿菌屬

動膠桿菌屬的典型特征是能形成菌膠團，而菌膠團是活性污泥的重要結(jié)構(gòu)。 本屬的大多數(shù)菌種能夠產(chǎn)生高絮凝活性，能夠與有機物結(jié)合成絮狀，使重金屬離 子、P元素沉淀，使水體凈化，并且在最近的污水處理研究中也占有重要的地位。從活性污泥中分離得到的動膠桿菌對于多種有機毒物也有降解作用。

2.2 叢毛單胞菌屬

叢毛單胞菌屬和動膠桿菌屬都屬于活性污泥中最占優(yōu)勢的菌群，對于構(gòu)成菌膠團也有重要的作用，除了可以吸附廢水中的難降解有機物外，對于多種有機毒性分子也有降解作用，如叢毛單胞菌AN3菌株可降解苯胺，叢毛單胞菌CNB1菌株可降解對氯硝基苯等，因此，對于水的凈化具有十分重要的意義，在污泥形成時應(yīng)該著重培養(yǎng)。

2.3 放線菌

活性污泥處理廠的曝氣池和二次澄清池中形成穩(wěn)定泡沫和浮渣的報道很多。泡沫阻礙固體和液體分離，是活性污泥處理廠的一大問題。泡沫形成一般是由于含分枝菌酸的放線菌的生長和積聚造成的。泡沫和浮渣對于廢水處理效果和環(huán)境都有一定的影響，因此在污泥的生成和廢水處理過程中應(yīng)該注意控制此類細菌的生長。

2.4 絲狀菌

絲狀菌是活性污泥的重要組成成分，是構(gòu)成菌膠團不可缺少的一部分，按絲狀菌相對的生長狀況及數(shù)量多少菌膠團分為5個等級：A級：幾乎沒有絲狀菌；B級：0～3根，屬少量絲狀菌；C級：3～6根，屬中等數(shù)量的絲狀菌；D級：6根以上，屬大量絲狀菌；E級：絲狀菌過量生長，絲狀菌延伸纏繞在一起或呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)。 當絲狀菌達D級時，大量絲狀菌從絮粒中伸展出來，形成“刺毛球”狀的活性污泥骨架。這些伸向絮粒外部的無數(shù)“觸手”阻礙了絮粒間的壓縮，使污泥在二沉池大量流失。此時應(yīng)立即檢查各項運行條件，及時調(diào)整，因為從絮體中伸出的絲狀菌具有較強的奪取食物和繁殖的能力，一旦繼續(xù)增長，就會擺脫絮體的束縛致使絮體破碎，從而發(fā)展成為嚴重的絲狀菌性污泥膨脹。

3 活性污泥中微生物菌群的主要研究進展

3.1 傳統(tǒng)的活性污泥微生物菌群分析方法

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法是將定量樣品接種于高濃度營養(yǎng)物的選擇性培養(yǎng)基中，對生長的菌落計數(shù)，并通過觀察各種微生物的生理生化特性及形態(tài)構(gòu)造等進行種屬分類鑒定。作為微生物研究的經(jīng)典手段之一，分離培養(yǎng)方法在研究活性污泥菌群過程中起到十分重要的作用。

此法要求比較簡單，很適合用來分離一些具有一定功能的微生物，還常用于一些科研工作者的初步研究。但是此法有很大的局限性：培養(yǎng)基對某些菌群的選擇性；某些細菌和其它細菌之間有共生現(xiàn)象，不能單獨生長（此類細菌占至今未能培養(yǎng)微生物的很大一部分）；很多細菌具有難以分辨的相似形態(tài)、生理生化特性。所以，此方法不能真實反映活性污泥菌群結(jié)構(gòu)，尤其是對那些具有重要功能仍未能培養(yǎng)的菌群的檢測。

由于傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)在研究微生物多樣性及其作用機理方面存在很大局限性，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法只能檢測到很少部分細菌（占細菌總數(shù)的0.1%～1%），且培養(yǎng)分離周期長，工作量大，使得現(xiàn)有污水處理工藝中生物脫氮除磷與微生物之間的構(gòu)效關(guān)系研究仍處于初級階段。例如：生物標記物法中的脂肪酸圖譜法雖然能夠快捷有效地從環(huán)境樣品中提取脂肪酸進行微生物菌群結(jié)構(gòu)的分析，但也有一定的局限性：對微生物的分類水平較低，不能鑒定到種；對標記脂肪酸有強烈的依賴性；復(fù)雜的環(huán)境微生物樣品中不同微生物種屬之間脂肪酸組成的重疊和外來生物污染容易導(dǎo)致一定的偏差。醌類圖譜分析術(shù)雖然是一種可靠的分析方法，然而也存在一定的局限性，它不能反映具體某個屬或種的變化。

3.2 新發(fā)展的微生物菌群分析方法

近十余年來日益成熟的分子生物學(xué)分析方法給菌群結(jié)構(gòu)的解析帶來了新的希望。自20世紀80年代中期以來，包括呼吸鏈泛醌分析技術(shù)、核酸雜交分析技術(shù)、聚合酶鏈式反應(yīng)分析技術(shù)、溫度梯度膠凝膠電泳分析和16srRNA序列分析技術(shù)等在內(nèi)的微生物分子生物學(xué)方法的研究和應(yīng)用方面獲得了飛速發(fā)展，極大程度地克服了環(huán)境樣品研究中傳統(tǒng)微生物分析方法固有的局限性，使廢水生物處理系統(tǒng)的微生物生態(tài)研究及其在廢水生物處理實踐的應(yīng)用擁有了十分先進的科學(xué)手段。這些新的分析方法，只需從混合的微生物樣品提取總DNA，得到若干個基因組的混合物，然后通過分子標記技術(shù)分析混合物中不同基因組的多態(tài)型來反映樣品的微生物種類組成。

3.2.1 16SrRNA—PCR技術(shù)

16SrDNA克隆文庫技術(shù)可以通過直接從環(huán)境樣品中提取微生物DNA或直接在原位對微生物進行研究，而不需對微生物進行分離培養(yǎng)，因而能夠動態(tài)考察微生物種群結(jié)構(gòu)，能夠真實地反映微生物在處理系統(tǒng)內(nèi)的真實存在情況。

高平平、趙立平等人在對含酚廢水生物處理系統(tǒng)的研究中，針對4種不同類型的降酚菌設(shè)計專一性引物和探針，通過PCR擴增監(jiān)測這些菌群在活性污泥中的動態(tài)變化及生態(tài)功能和地位，并將降酚菌的分類地位至少可以確定到屬的水平。近年來也有人采用16srRNA—LPM方法分析活性污泥中主要微生物優(yōu)勢種類以及系統(tǒng)多樣性的變化。它是采用基于長度多態(tài)性（Length Polymorphism）和GC含量的二維16srDNA分析方法，可以有效地分析環(huán)境中的細菌，特別是使用16srDNA中的變異區(qū)域I時，方法會更簡便和有效。謝冰等人利用16srRNA—LPM方法分析了受重金屬污染的活性污泥微生物生態(tài)系統(tǒng)中細菌的優(yōu)勢種類和多樣性。

3.2.2 DGGE／TGGE技術(shù)

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展和聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)的日趨成熟，一些基于PCR技術(shù)的分子指紋技術(shù)，如：變性梯度凝膠電泳、末端限制性片段多態(tài)性和長度多態(tài)片段PCR，已開始應(yīng)用于環(huán)境微生物種群結(jié)構(gòu)和多樣性分析。這些方法不受微生物實驗室培養(yǎng)的限制，可以獲取相對全面的種群信息。

變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE）和溫度梯度凝膠電泳（Temperature Gradient Gel Eleectrophoresis TGGE）都是DNA指紋圖譜技術(shù)。新近研究表明，DGGE對有多個不同堿基序列差異的DNA片段的分離有局限性，Sekiguchi等人認為，DGGE方法可能低估了環(huán)境微生物的種群多樣性。所以必須把DGGE/TGGE和其它分子生物學(xué)方法相結(jié)合才能對環(huán)境樣品中的微生物種群多樣性進行更為準確的描述。

1993年Muyzer等首次將DGGE用于微生物生態(tài)學(xué)研究，分析了分子大小相同但序列不同的16srDNA片段，根據(jù)不同細菌其核糖體小亞基基因可變區(qū)堿基序列的不同，對其種群多樣性、數(shù)量比例和系統(tǒng)等進行更為詳盡的描述。DGGE和TGGE在微生物分子生態(tài)學(xué)方面的應(yīng)用，不僅使得人們對復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)的解析成為可能，也使得對微生物種群動態(tài)變化的研究成為可能，通常用指紋圖譜中條帶數(shù)目的多少來反映微生物種群的多樣性，用條帶的染色強度反映不同細菌種群的豐度。高平平、晁群芳等人用16srDNA—PCR／TGGE指紋圖譜技術(shù)對一個焦化工業(yè)廢水處理系統(tǒng)兩個功能不同的曝氣池活性污泥的細菌種群結(jié)構(gòu)進行了動態(tài)分析，研究結(jié)果表明，兩個曝氣池中主要降解細菌類群是不同的。

3.2.3 微生物醌指紋法

除遺傳基因外，近年來以特征化合物—微生物醌為標記的新的微生物群體組成解析方法，即醌指紋（Quinone Profile）法在環(huán)境微生物群體組成研究中有大量應(yīng)用。該技術(shù)已經(jīng)成為分析微生物種群的簡單有效、靈敏度高、數(shù)據(jù)的信賴性高的方法，并成功地應(yīng)用于生活污水和工業(yè)廢水生物處理過程中微生物群體組成的確定。清華大學(xué)胡洪營等人利用醌指紋法對某一污水處理廠曝氣池活性污泥微生物群體組成進行了研究，結(jié)果顯示，在所研究的活性污泥中革蘭氏陽性細菌含量高于革蘭氏陰性。然而，醌指紋法也存在一定的局限性，它不能反映具體哪個屬或哪個種的變化，因此如需對活性污泥中的微生物生態(tài)系統(tǒng)進行更詳細的分析，還應(yīng)結(jié)合其他方法進行深入研究。3.2.4 ERIC—PCR

ERIC（Enterobacterial Repetitive Intergenie Consensus，腸桿菌基因間的重復(fù)共有序列）是一個長度為126bp，以多拷貝形式存在于細菌基因組的非編碼區(qū)的反向重復(fù)序列，該序列在細菌染色體上分布的多態(tài)性允許設(shè)計特異引物對其進行擴增而形成具有種、屬、菌株特異性的指紋圖譜，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于純培養(yǎng)細菌的鑒別、分類、基因組多態(tài)性和系統(tǒng)進化等方面的研究。ERIC—PCR與其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合使用可以更加準確反映微生物群落結(jié)構(gòu)，趙立平等人就是用微生物群落結(jié)構(gòu)探針對不同培養(yǎng)基從活性污泥中回收優(yōu)勢菌的能力進行了評價。不同時期的活性污泥的總DNA的ERIC—PCR產(chǎn)物代表了樣品中優(yōu)勢菌組成特征，這些擴增產(chǎn)物經(jīng)標記后成為可以反映樣品中優(yōu)勢菌組成的核酸探針，即所謂“微生物群落結(jié)構(gòu)探針”。把不同培養(yǎng)基上分離到的所有細菌菌群混合，提取總DNA進行ERIC—PCR。用上述探針與回收菌的ERIC—PCR指紋圖雜交，出現(xiàn)的雜交條帶數(shù)目代表了活性污泥中的優(yōu)勢菌有多少被特定的培養(yǎng)基回收。

3.2.5 核酸探針分子雜交

核酸探針檢測技術(shù)以核酸分子雜交技術(shù)為核心，利用探針分析DNA序列及片段長度的多態(tài)性，具有特異性強、靈敏度高等特點，所以在生物多樣性及生態(tài)功能的研究中具有十分重要的應(yīng)用價值。Rossello—Mora等人利用專一的寡核苷酸探針研究了Zo—ogloea ramigera在活性污泥形成中的作用，結(jié)果表明絲狀菌的過度生長會導(dǎo)致污泥膨脹。

Kawaharasak等對從活性污泥中分離出的新的聚磷菌（如Microlunatus Phosphorous）進行了原位定量分析，通過比較探針標記的細胞數(shù)目和含聚磷酸鹽的細胞數(shù)目后認為，在EBPR除磷工藝中Microlunatus Phosphorous占整個含聚磷酸鹽的細胞總數(shù)的1/3。Hesselmann等和Crocetti等利用對β-Proteobacteria專一的探針，結(jié)合細胞內(nèi)聚磷酸鹽顆粒的特殊染色技術(shù)，鑒定了實驗室規(guī)模的除磷反應(yīng)器中占優(yōu)勢的微生物類群。

另外，專一性寡核苷酸探針在人們對硝化過程微生物的認識中也被廣泛應(yīng)用。不同的研究者利用不同的專一性探針對活性污泥、生物濾床等環(huán)境中的硝化細菌進行研究。

3.2.6 熒光原位雜交技術(shù)

近年來，針對傳統(tǒng)的微生物分析方法存在的問題，廢水處理領(lǐng)域的一些研究者開始嘗試將熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescent In Situ Hybridazation，F(xiàn)ISH）用于引起污泥膨脹的絲狀菌菌群、脫氮細菌菌群、除磷菌菌群、產(chǎn)甲烷菌菌群等的分析，并取得了初步的成功。謝冰、徐華等人采用FISH方法對活性污泥樣品中的硝化細菌進行了檢測，表明它對環(huán)境中的可用顯微鏡觀察但不可培養(yǎng)的微生物的檢測也是十分有效的。

FISH作為微生物數(shù)量和特性考察的手段，具有種屬特異性，即只與目標細菌的16SrRNA或23SrRNA結(jié)合，通過結(jié)合的探針可以鑒定微生物的種類。與其他可以將微生物量化的方法（如定量聚合酶鏈式反應(yīng)即PCR）相比，F(xiàn)ISH技術(shù)可以同時考察微生物種群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量信息。研究表明，技術(shù)對特定微生物種群定性和定量時，獲得結(jié)果快，可自動讀取保存和回顧載物片信息，靈敏度高選擇性好取樣易且少，并能提供較多的物理參數(shù)。

FISH技術(shù)的優(yōu)勢在于可以了解微生物在污泥中的數(shù)量、形態(tài)及分布狀態(tài)等，但其在應(yīng)用過程中還存在著檢測的假陽性、假陰性問題，諸如：微生物自身熒光的影響、探針缺乏特異性、穿透率不足、低rRNA含量和熒光褪色等。

4 展望

活性污泥法作為現(xiàn)在污水處理的主力已經(jīng)越來越受到人們的重視。活性污泥中的微生物菌群隨著現(xiàn)代研究方法的發(fā)展也逐漸被發(fā)現(xiàn)和認識，但是還沒有被認識完全，有些重要的菌群還沒有被發(fā)現(xiàn)。隨著各種科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的研究方法還將應(yīng)用于污泥微生物菌群分析，如免疫培養(yǎng)技術(shù)和現(xiàn)代培養(yǎng)技術(shù)在國外已經(jīng)取得了一定的成果，但是國內(nèi)相關(guān)研究很少。在國內(nèi)活性污泥菌群及其他環(huán)境微生物的研究中尚有很大的應(yīng)用前景。隨著新方法的建立，活性污泥的菌群結(jié)構(gòu)會更好地為人所認識。對于將來更好地利用活性污泥，揭示廢水處理系統(tǒng)中生物與環(huán)境之間的生態(tài)學(xué)關(guān)系以及為實現(xiàn)廢水處理系統(tǒng)的優(yōu)化運行具有深刻的理論研究意義與實際應(yīng)用價值。

（略）