4-甲基亞磺酰丁基硫苷（RAA）合成與代謝及遺傳特性的研究進(jìn)展

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(1宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,湖北宜昌 443004;2宜都市農(nóng)業(yè)局,湖北宜都 443300;3華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院,湖北武漢 430070)

4-甲基亞磺酰丁基硫苷（RAA）合成與代謝及遺傳特性的研究進(jìn)展

李念祖1☆史明會(huì)2，3☆牟 愔1盧夢玲1王友海1*萬正杰3

(1宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,湖北宜昌 443004;2宜都市農(nóng)業(yè)局,湖北宜都 443300;3華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院,湖北武漢 430070)

4-甲基亞磺酰丁基硫苷(glucoraphanin,RAA)是具天然抗癌特性的蘿卜硫素的前體,在十字花科蔬菜尤其是青花菜中含量較高,因此對RAA的研究也成為學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn)。本文綜述了RAA的合成與代謝及其遺傳特性的研究進(jìn)展,同時(shí)展望了分子標(biāo)記在此領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用前景。

4-甲基亞磺酰丁基硫苷;青花菜;代謝;遺傳特性;綜述

硫苷物質(zhì)在病蟲害預(yù)防、植物保護(hù)、蔬菜風(fēng)味、逆境生理與疾病預(yù)防等諸多方面發(fā)揮著重要作用(Aires et al.,2009;Bressan et al.,2009; Agerbirk et al.,2010)。4-甲基亞磺酰丁基硫苷(glucoraphanin,RAA)又稱萊菔子苷,分子式為C12H21NO10S3,分子量為403.29,是脂肪族硫苷的一種。研究發(fā)現(xiàn),青花菜等十字花科蔬菜富含硫苷成分,當(dāng)植物受到外力破壞、機(jī)械損傷或昆蟲咬食時(shí),位于液泡內(nèi)的硫苷成分會(huì)被釋放出來與黑芥子酶(myrosinase)發(fā)生水解反應(yīng),生成各種次生代謝產(chǎn)物,如硫氰酸酯、異硫氰酸酯、腈類等(何洪巨等,2002;陳新娟 等,2006;Liang et al.,2006;吳元鋒 等,2009;謝祝捷 等,2010;Agerbirk et al.,2010)。RAA在植物內(nèi)源黑芥子酶或腸道中微生物群的作用下降解為具有生物活性的蘿卜硫素(sulforaphane)。試驗(yàn)證明,蘿卜硫素具有極強(qiáng)的抗癌特性,主要表現(xiàn)在抗氧化功能、消炎特性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期性死亡等方面(Juge et al., 2007)。

本文主要介紹了RAA在植物體內(nèi)的合成及代謝,同時(shí)綜述了國內(nèi)外對RAA遺傳特性的研究及最新動(dòng)態(tài),為深入研究RAA的分子調(diào)控機(jī)制及高RAA含量青花菜的選育提供參考。

1 RAA的合成與代謝

1.1 RAA的合成

RAA是側(cè)鏈來源于蛋氨酸的脂肪族硫苷,其生物合成分為兩個(gè)階段：① 側(cè)鏈延伸單位——雙高蛋氨酸(DHM)的形成階段。該過程由側(cè)鏈延伸機(jī)制中的兩個(gè)連續(xù)的循環(huán)反應(yīng)完成。蛋氨酸在細(xì)胞質(zhì)中通過支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶4(BCAT4)催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)進(jìn)入側(cè)鏈延伸機(jī)制,生成的α-酮酸被轉(zhuǎn)移到葉綠體。這個(gè)階段中由MAM1、BCT4和BCT3催化的反應(yīng)與亮氨酸的生物合成反應(yīng)類似,反應(yīng)物在AC和IPM的催化作用下經(jīng)過兩個(gè)循環(huán)反應(yīng)后生成2-氧-6-甲基硫代己酸,之后在BCT3催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)下生成DHM(Kroymann et al.,2001; Schuster et al.,2006;Knill et al.,2008;Sawada et al.,2009)。② DHM進(jìn)入脂肪族硫苷經(jīng)修飾生成RAA的階段。該反應(yīng)由細(xì)胞質(zhì)中的8個(gè)活性酶(依次為CYP79F1、YP83A1、GGP1、SUR1、AtST5b、FMO、UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)催化完成,其中FMO是氨基酸側(cè)鏈被硫氧化成RAA這一修飾過程的關(guān)鍵酶(Klein et al.,2006;Hansen et al.,2007;Geu-Flores et al.,2009)。

目前,RAA合成過程中相關(guān)的主要合成和調(diào)節(jié)基因已得到了驗(yàn)證,分別是由MAM、CYP79/ CYP83、AOP等合成基因家族起決定作用(鄭建仙,2005;周榮漢和段金廒,2005),而轉(zhuǎn)錄因子MYB基因家族在硫苷的生物合成過程中則起著調(diào)節(jié)上述基因表達(dá)的作用(Yan & Chen,2007)。

1.2 RAA的代謝

RAA一般貯存在植物液泡中,而黑芥子酶位于特定蛋白體中。正常情況下,兩者相互分離且相對穩(wěn)定。當(dāng)植物組織受到咀嚼或細(xì)胞滲透性增強(qiáng)時(shí),細(xì)胞的代謝區(qū)隔遭到破壞,特定蛋白體中的黑芥子酶被釋放出來并與RAA接觸,RAA經(jīng)黑芥子酶水解產(chǎn)生具有較強(qiáng)抗癌特性的異硫氰酸鹽——SF (鄭建仙,2005)。烹飪過程中,青花菜內(nèi)源黑芥子酶由于高溫變性失活,但將烹飪后的青花菜喂食無菌小鼠,在其尿液中檢測到了SF(無菌小鼠的腸道內(nèi)無內(nèi)源黑芥子酶,且用抗生素進(jìn)行了腸道處理),表明小鼠盲腸中的微生物群落可以將RAA轉(zhuǎn)化為SF,進(jìn)而穿過盲腸壁被吸收;同時(shí)也證實(shí)了RAA在整個(gè)消化系統(tǒng)中是以完整的形式到達(dá)盲腸區(qū),中間無代謝反應(yīng)(Lai et al.,2010)。

2 青花菜中RAA的研究

2.1青花菜中RAA含量的研究

研究表明,青花菜中RAA含量約占脂肪族硫苷含量的80%,占總硫苷含量的62%(Brown et al.,2002)。近年來國內(nèi)外對不同品種青花菜中RAA含量的研究越來越多。Kushad等(1999)對50個(gè)青花菜品種的花球RAA含量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)品種間RAA含量最大相差27倍且差異均達(dá)顯著水平;邱海榮等(2008)利用反相高效液相色譜法檢測了3個(gè)不同品種青花菜的RAA含量,結(jié)果與Kushad等(1999)的研究結(jié)果一致;姚雪琴等(2011)對24份青花菜材料的花球、莖和葉片中RAA含量進(jìn)行測定,結(jié)果顯示青花菜不同器官的RAA含量差異極顯著,花球中含量最高,莖次之,葉片最低。以上研究為高RAA含量青花菜品種的選育工作奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為定位RAA高含量表達(dá)相關(guān)基因提供了平臺(tái)。

2.2 RAA含量在青花菜生命周期中的變化

青花菜不同發(fā)育階段及同一階段不同組織中的RAA含量不同。Rangkadilok等(2002)研究指出,青花菜中RAA含量從幼苗期到綠色花球期持續(xù)增長,開花期開始下降。在綠色花球期,青花菜花球中的RAA含量顯著高于其他營養(yǎng)器官;而開花期花球中的RAA含量雖然高于莖和葉柄,但差異不顯著。青花菜種子中的RAA含量也引起了研究者的熱切關(guān)注。Lee等(2010)在前人的研究基礎(chǔ)上,以NaClO3為膠粒相,采用膠束動(dòng)電毛細(xì)血管法定量測定了青花菜種子、嫩芽及抱子甘藍(lán)嫩芽中的RAA含量,結(jié)果顯示青花菜種子中的RAA含量最高(平均為13 300 mg·kg-1),嫩芽次之(890 mg·kg-1),抱子甘藍(lán)嫩芽中的RAA含量最低(30 mg·kg-1)。

2.3基因型和環(huán)境互作對青花菜RAA含量的影響

Farnham等(2000)在研究多個(gè)青花菜品種的RAA含量時(shí)發(fā)現(xiàn),基因型在控制RAA于花球中的表達(dá)起重要作用,這與Faulkner等(1998)的研究結(jié)果一致。Farnham等(2005)對生長在兩種不同環(huán)境條件下的10個(gè)青花菜自交系種子中的RAA含量進(jìn)行測定,同時(shí)還進(jìn)行了基因型和環(huán)境因素對種子中RAA含量影響的方差分析,結(jié)果表明基因型和環(huán)境及兩者的相互作用均對RAA含量具有顯著影響,其中基因型的影響最大。Vallejo等(2003)報(bào)道,冬季種植時(shí)青花菜栽培品種Marathon的RAA含量是Rosa和Rodrigues的1/3;Abercrombie等(2005)檢測6個(gè)參試親本的花球RAA含量,均比1998年的檢測值低,表明基因×環(huán)境的互作對青花菜花球中RAA含量也具有重要影響。謝祝捷等(2010)研究了基因型和環(huán)境互作對青花菜RAA含量的影響,結(jié)果顯示基因型對青花菜RAA含量的影響達(dá)極顯著水平,其相應(yīng)的變異來源占總變異來源的67.3%,大于Farnham等(2004)報(bào)道的53.8%;栽培地點(diǎn)的影響及其與基因型的互作效應(yīng)均達(dá)顯著水平,而栽培年份及其相關(guān)互作效應(yīng)不顯著,與Brown等(2002)的研究結(jié)果相似。

2.4 RAA的遺傳背景

許多野生甘藍(lán)種的RAA含量比栽培品種要高(Giamoustaris & Mithen,1996)。Faulkner等(1998)將栽培品種Green Duke與野生甘藍(lán)品種進(jìn)行雜交,雜交后代的RAA含量和誘導(dǎo)苯醌還原酶活性的能力分別是栽培品種的10倍和100倍,原因歸結(jié)為野生甘藍(lán)品種在基因水平改變了栽培品種的遺傳背景,RAA含量的增加促使其轉(zhuǎn)化為更多的蘿卜硫素。Mithen等(2003)通過基因滲入的方法,將野生品種中的3個(gè)基因片段轉(zhuǎn)入青花菜栽培品種后,青花菜栽培品種的蘿卜硫素含量明顯提高,這與Farnham等(2000)的研究結(jié)果類似,同時(shí)也證明基因型在RAA的表達(dá)中起重要作用,而控制RAA高水平表達(dá)的基因存在于表型優(yōu)良的種質(zhì)中。

3 RAA的代謝調(diào)控

硫苷在蕓薹屬作物中的合成是受基因型和環(huán)境因素共同調(diào)節(jié)的數(shù)量性狀遺傳,QTL是研究硫苷表達(dá)及其含量調(diào)控相關(guān)基因的有效方法。研究者在模式植物擬南芥中對硫苷的生物合成相關(guān)基因和功能特性進(jìn)行了QTL分析(Kliebenstein et al.,2001a, 2001b;Brown et al.,2003;Textor et al.,2007;Li et al.,2008)。QTL分析表明,AOP和GS-elong (MAM)兩個(gè)基因家族在脂肪族硫苷的調(diào)控和積累方面起著至關(guān)重要的作用,其中MAM在側(cè)鏈延伸過程中發(fā)揮作用,而AOP的作用表現(xiàn)在側(cè)鏈修飾環(huán)節(jié)(Kliebenstein et al.,2001a;Field et al., 2004;Heidel et al.,2006)。

在擬南芥種間雜交群體Ler×Cvi中找到1個(gè)與種子和葉片中總硫苷含量相關(guān)的QTL,同時(shí)脂肪族硫苷的表達(dá)受到6個(gè)QTL的共同作用,其中2個(gè)位點(diǎn)與AOP和MAM的互作相關(guān)(Kliebenstein et al.,2001c),這2個(gè)位點(diǎn)在Wentzell等(2007)的研究中得到印證;以擬南芥種間雜交群體Ler×ColRI為研究基礎(chǔ)時(shí),在2條染色體上找到5個(gè)與脂肪族硫苷相關(guān)的QTL,解釋了總變異的60% (Kliebenstein et al.,2002);而擬南芥種間雜交群體Da(1)×Ei-2中總脂肪族硫苷的表達(dá)受3個(gè)QTL控制,1個(gè)與AOP連鎖,1個(gè)在5號(hào)染色體頂端,另1個(gè)被新定位到1號(hào)染色體上(Kroymann et al.,2003)。一系列生態(tài)型擬南芥基因?qū)W研究表明,MAM位點(diǎn)位于5號(hào)染色體頂端,促使脂肪族硫苷的表達(dá)(Kliebenstein et al.,2001a)。Heidel等(2006)在對擬南芥lyrata種間雜交群體中MAM位點(diǎn)進(jìn)行研究時(shí)找到2個(gè)與硫苷表達(dá)相關(guān)的QTL,其中1個(gè)是控制脂肪族硫苷比例的QTL,位于MAM位點(diǎn)附近。

但是,在蕓薹屬作物中并沒有得到關(guān)于硫苷生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和終產(chǎn)物功能修飾等的具體信息。Uzunova等(1995)在甘藍(lán)型油菜DH群體中找到4個(gè)與種子總硫苷表達(dá)相關(guān)的QTL位點(diǎn),解釋了總表型變異的61%。Toroser等(1995)應(yīng)用RFLP技術(shù),利用甘藍(lán)型油菜DH群體構(gòu)建連鎖圖,定位到2個(gè)主效基因和3個(gè)微效基因的QTL位點(diǎn)。這些研究表明種子中總硫苷的生物合成同時(shí)受到基因加性效應(yīng)和上位效應(yīng)控制,這一結(jié)論在對青花菜花球中RAA的遺傳特性進(jìn)行研究時(shí)得以印證(史明會(huì) 等,2014)。目前,已在甘藍(lán)中克隆出與擬南芥AOP和MAM同源的基因,是甘藍(lán)中脂肪族硫苷合成途徑的關(guān)鍵因子(Li & Quiros,2003);廖永翠等(2011)在研究大白菜中脂肪族硫苷代謝調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn),AOP2的存在引起NAP含量和PRO含量升高,而降低了RAA的生成與積累。除了以上結(jié)構(gòu)基因外,一些轉(zhuǎn)錄因子也會(huì)影響脂肪族硫苷的表達(dá),如IQD1等(Celenza et al.,2005)。盡管環(huán)境和生長因子會(huì)影響基因的表達(dá),但基因型是硫苷含量的重要影響因素。

RAA是存在于青花菜中的高含量天然次級(jí)代謝物,有研究指出青花菜之所以富含RAA,是因?yàn)槠浠蚪M中缺少GSL-ALK這一功能位點(diǎn)(Tawfiq et al.,1995)。近年來,研究者們對青花菜中硫苷合成和積累相關(guān)基因的定位進(jìn)行了報(bào)道。Mithen等(2003)在青花菜中找到1個(gè)與RAA和3-甲基亞磺酰丙基硫苷表達(dá)相關(guān)的差異性等位基因QTL位點(diǎn);Sarikamis等(2005)采用微衛(wèi)星定位法將該QTL位點(diǎn)定位到了染色體O2上,同時(shí)又在染色體O5上定位到1個(gè)新的與硫苷表達(dá)相關(guān)的QTL位點(diǎn),但沒有明確控制RAA合成的QTL位點(diǎn)。Gao等(2007)利用青花菜DH系Early-Big和花椰菜DH系A(chǔ)n-Nan Early雜交得到的分離群體F2,構(gòu)建了含有1 257個(gè)標(biāo)記的高密度基因圖譜,發(fā)現(xiàn)多個(gè)硫苷合成途徑的相關(guān)基因：BoGSL-ELONG被定位在染色體LG2上;BoS-GT在染色體LG3上;BoGSLPROa、BoGSL-PROb和BoCYP79F1在染色體LG5上,前兩者的距離為0.027 cM;BoCS-lyase在染色體LG6上;而BoGSL-ALK和BoGS-OH均在染色體LG9上,兩者的距離為5.4 cM。

4 結(jié)論與展望

目前,對RAA的合成、代謝及其遺傳特性已有研究,但是RAA合成途徑的基因網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜,整個(gè)過程涉及到多個(gè)關(guān)鍵基因。同時(shí),環(huán)境因素的改變也將影響到硫苷含量的表達(dá),如光質(zhì)、溫度、鹽脅迫、肥料等,這些非生物因素對RAA含量的影響是通過何種調(diào)控途徑來實(shí)現(xiàn)的,還需進(jìn)一步探究。此外,對蕓薹屬脂肪族硫苷含量的調(diào)控基因已有大量研究報(bào)道,但對青花菜中控制RAA含量表達(dá)的基因還未進(jìn)行精細(xì)定位。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,高通量測序、分子標(biāo)記技術(shù)及基因靶向修飾技術(shù)已廣泛應(yīng)用到各個(gè)研究領(lǐng)域,因而運(yùn)用多種生物技術(shù)來探究青花菜中調(diào)控RAA含量的相關(guān)基因,對高RAA含量青花菜的選育工作具有重要的應(yīng)用意義。

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Research Progress in Metabolism and Hereditary Traits and Genetic Characteristics of Glucoraphanin

LI Nian-zu1,SHI Ming-hui2,3,MOU Yin1,LU Meng-ling1,WANG You-hai1*,WAN Zheng-jie3

(1Yichang City Institute of Agricultural Sciences,Yichang 443003,Hubei,China;2Yidu City Agriculture Bureau, Yidu 443300,Hubei,China;3College of Horticulture and Forestry Sciences,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,Hubei,China)

Glucoraphanin is the bioprecursor of sulforaphane with natural chemopreventive and anticarcinogen characteristics．Its content is high in cruciferae vegetables,especially in broccoli．Studies on glucoraphanin have become the hot topics recently．This paper reviews the research progress made at home and abroad on synthesis,metabolism and genetic characteristics of glucoraphanin．The paper also prospects the broader application of molecular marker in this area．

Glucoraphanin;Broccoli;Metabolism;Genetic characteristics;Review

☆兩作者對本文具同等貢獻(xiàn)。

李念祖,男,助理農(nóng)藝師,專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種與生物技術(shù),E-mail：linianzu@sina.cn

史明會(huì),女,助理農(nóng)藝師,專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種,E-mail：minghuishi0213@163.com

*通訊作者(Corresponding author)：王友海,男,高級(jí)農(nóng)藝師,專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種,E-mail：337316007@qq.com

2014-07-02;接受日期：2014-08-25

宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院果蔬創(chuàng)新育種項(xiàng)目