胰島素對葡萄糖轉(zhuǎn)蛋白4轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展

江 雷 龔 劍 江 波

(安徽建筑大學(xué)，安徽 合肥 230022)

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)4是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，主要分布在骨骼肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，在胰島素刺激或肌肉收縮運(yùn)動時，促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖。在GLUT家族中，只有GLUT4參與骨骼肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的GLUT循環(huán)。在靜息狀態(tài)下，GLUT4迅速轉(zhuǎn)向細(xì)胞內(nèi)，而且向細(xì)胞膜的再轉(zhuǎn)運(yùn)過程很緩慢。由于細(xì)胞對GLUT4緩慢的胞吐作用和快速的內(nèi)吞作用，超過90%的GLUT4在細(xì)胞內(nèi)，只有4%～10%在細(xì)胞膜上。GLUT4在靜息狀態(tài)下積聚在細(xì)胞內(nèi)囊泡膜上，這些囊泡包括反式高爾基網(wǎng)(TGN)、再循環(huán)內(nèi)體(RE)、不同的管囊狀小體。GLUT4對胰島素作用反應(yīng)敏感，表現(xiàn)為在細(xì)胞膜上含量迅速增加，在細(xì)胞內(nèi)含量迅速下降。脂酰肌醇3-激酶(PI 3-kinase)IAⅢ型在GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用。在少量鳥昔三磷酸(GTP)酶的作用下，PI 3-kinase→非典型蛋白激酶PKC和→Aκt/PKB →AS160是GLUT4向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要調(diào)節(jié)通路。近10年，對GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)信號調(diào)節(jié)的研究取得較大進(jìn)展。本文就Akt/PKB下游事件，含GLUT4囊泡的來源，GLUT4在細(xì)胞膜上募集、錨定、融合等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 用于研究GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞模型

很多對于GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的認(rèn)識和研究是通過對肌肉和脂肪細(xì)胞系的研究得來的。這些細(xì)胞系與成熟細(xì)胞很相似，但又不完全相同。3T3-L1脂肪細(xì)胞被認(rèn)為是較好的模型而廣泛運(yùn)用。3T3-L1脂肪細(xì)胞在接受胰島素刺激后，對葡萄糖的攝取比基礎(chǔ)水平提高10倍，而分離出來的大鼠脂肪細(xì)胞提高20倍，人的脂肪細(xì)胞則只提高2～3倍。在3T3-L1脂肪細(xì)胞，GLUT4主要儲存在細(xì)胞核周圍的囊泡膜上，在細(xì)胞質(zhì)其他部位的囊泡含量很少。有研究表明，細(xì)胞中存在特定的含GLUT4小室，受胰島素調(diào)節(jié)，在最后的與細(xì)胞膜融合過程中需要突出小泡膜蛋白(VAMP)2存在并發(fā)揮作用。這些小室被命名為專門小室(SC)和GLUT4儲存囊泡(GSV)〔1〕。胰島素既能促進(jìn)GLUT4從RE向SC/GSV轉(zhuǎn)運(yùn)，又能促進(jìn)GLUT4從SC/GSV向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)〔2〕。在成熟的脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞，GLUT4能較長時間保持活性(半衰期大約40 h)，所以每一個多肽鏈在其活性狀態(tài)可以多次循環(huán)到細(xì)胞膜上。

肌肉和脂肪細(xì)胞受到胰島素刺激后，GLUT4胞吐速率迅速增加，內(nèi)吞作用少量減少，10～15 min細(xì)胞膜上的GLUT4即可達(dá)到峰值。胰島素受體1磷酸化， PI 3-kinase、PKC、Akt/PKB的活性提高也參與調(diào)節(jié)。包括Cbl-CAP-APS-Crk Ⅱ-C3G-TC10序列的PI3激酶信號因子促進(jìn)脂肪細(xì)胞膜獲得GLUT4，而對肌肉細(xì)胞沒有作用。在肌肉細(xì)胞，PI3激酶促進(jìn)表層肌動蛋白重建，不受Akt約束。重建的表層肌動蛋白可能參與“熱點(diǎn)”的產(chǎn)生，所以對細(xì)胞膜獲得GLUT4有關(guān)鍵作用。“熱點(diǎn)”是胰島素信號因子作用于細(xì)胞以及囊泡與細(xì)胞膜融合的位置。

2 胰島素對GLUT4儲存和胞吐作用的調(diào)節(jié)

目前一致公認(rèn)，細(xì)胞膜依靠胰島素獲得GLUT4需要IA家族PI3激酶。但是PI3激酶是否參與GLUT4在小室的儲存、 GLUT4向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的動員、轉(zhuǎn)運(yùn)體的內(nèi)吞，直到最近才有所了解。Foster等〔3〕研究表明，GLUT4在內(nèi)體間快速轉(zhuǎn)運(yùn)需要PI3激酶的活化。Yang等〔4〕研究表明，細(xì)胞膜上的PI3激酶對轉(zhuǎn)運(yùn)體胞吐的作用比內(nèi)吞作用更明顯。IA家族PI3激酶受胰島素刺激后,生成磷酸肌醇PI(3,4,5)P3。PI(3,4,5)P3通過載體進(jìn)入脂肪細(xì)胞或肌肉細(xì)胞，能提高GLUT4向細(xì)胞膜的動員〔5〕。

磷酸肌醇信號可能是通過PDK1及其下游分子PKB、PKCζ/λ傳導(dǎo)。運(yùn)用失活突變型、特定的基因敲除或基因沉默技術(shù)，表明這些酶在胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞膜獲得GLUT4的過程中都起作用〔6〕。PKCλ與胞外分泌有關(guān)，與驅(qū)動蛋白KIF3B結(jié)合的Rab4酶突變失活，則這一作用被抑制。Rab4酶被認(rèn)為調(diào)節(jié)GLUT4通過微管向細(xì)胞膜動員。

Akt/PKB與GLUT4循環(huán)的多個步驟有關(guān)。Akt/PKB進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)小室的證據(jù)包括：①在胰島素作用下，Akt/PKB向含GLUT4的內(nèi)膜轉(zhuǎn)移〔7〕；②在Akt/PKB表達(dá)缺陷的細(xì)胞中，阻止了GLUT4在內(nèi)體間的快速轉(zhuǎn)運(yùn)〔8〕；③有活性的Akt/PKB作用于含GLUT4的小室， GLUT4嵌合體與Akt/PKB融合〔8〕，IRAP(SC/GSV的替代運(yùn)輸?shù)鞍?與細(xì)胞膜融合〔9〕；④在Akt/PKB表達(dá)缺陷的3T3-L1脂肪細(xì)胞，阻止胰島素促使的GLUT4易位〔9〕，在大鼠脂肪細(xì)胞無此現(xiàn)象〔8〕。AS160是Akt/PKB的底物。突變的AS160被稱為AS160-4P，Akt/PKB與它作用相對應(yīng)的4個靶點(diǎn)發(fā)生變異。AS160-4P可抑制胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞膜GLUT4增加〔10〕。運(yùn)用全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)，用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記GLUT4，形成 GFP-GLUT4。在表達(dá)AS160-4P的細(xì)胞，在膜周圍沒有發(fā)現(xiàn)胰島素刺激引起的來自RE的GFP-GLUT4和含GFP-GLUT4的囊泡〔10〕。這些結(jié)論表明，AS160可能參與了胰島素誘導(dǎo)的GLUT4從SC/GSV的外流，而AS160-4P阻止GLUT4的外流。最近，在免疫純化的含GLUT4的小室(包括SC/GSV，可能還有其他的含GLUT4的囊泡)，AS160有3個可能的Rab靶點(diǎn)(Rab 2A，8A，14)被發(fā)現(xiàn)〔11〕。進(jìn)一步研究揭示Rabs和其靶點(diǎn)，在從胰島素受體到胰島素敏感的含GLUT4的小室之間的信號通路中可能起作用。Rab11調(diào)節(jié)膜蛋白從內(nèi)體向膜和從內(nèi)體向(TGN)的轉(zhuǎn)運(yùn)。Rab11拮抗肽的表達(dá)阻止GLUT4從富含TfR的小室分離，說明其可能與GLUT4在內(nèi)體小室間的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)〔12〕。

3 胰島素對GLUT4入胞作用的調(diào)節(jié)

入胞作用包括入胞的起始階段和經(jīng)入胞途經(jīng)對內(nèi)吞蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。GLUT4的入胞主要經(jīng)由網(wǎng)格蛋白小窩。GLUT4通過與接頭蛋白2的μ2亞單位的相互作用，在GTP酶發(fā)動蛋白的幫助下，使含GLUT4囊泡從膜上分離。陷窩蛋白(caveolin)對GLUT4入胞也起作用。與肌動蛋白微絲共定位的EH結(jié)構(gòu)域綁定蛋白(EHD)2和它的伴侶EHD2-結(jié)合蛋白(EHBP)1與GLUT4的入胞有關(guān)。它們的基因沉默減少GLUT4的入胞〔12〕。然而，因?yàn)榫W(wǎng)格蛋白和它關(guān)聯(lián)的適配蛋白與EHBP1作用于不同的蛋白入胞過程，GLUT4的入胞機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

胰島素降低GLUT4的入胞速率，通過內(nèi)吞囊泡加速其轉(zhuǎn)運(yùn)〔3〕。胰島素延緩GLUT4入胞的信號通路仍然需要研究。過度表達(dá)AS160-4P輕微增加膜上GLUT4的入胞作用，說明AS160在這一過程中可能起作用〔10〕。初生的入胞小泡迅速(2 min內(nèi))轉(zhuǎn)運(yùn)到早期內(nèi)體(EE)，再到RE。胰島素降低存在于EE的GTP酶 Rab5的活性；在PI3激酶存在的情況下，也降低馬達(dá)動力蛋白與微管相互作用。這些事件延緩了GLUT4從細(xì)胞膜到EE的進(jìn)程。隨后，胰島素加速GLUT4通過RE向SC/GSV的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且這一過程與IA家族PI3激酶和Akt/PKB有關(guān)〔3〕。含GLUT4內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)可能還有PI5激酶PIKfyve的參與。雖然PI5激酶PIKfyve能被Akt/PKB磷酸化，但是，胰島素對其活性的影響還需要進(jìn)一步研究。

4 胰島素對含GLUT4囊泡與細(xì)胞膜融合的調(diào)節(jié)

除了上述IA家族PI3激酶參與含GLUT4內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)，近來有報道，抑制這些酶的活性，仍然在細(xì)胞內(nèi)周緣獲得大量沒有完成對膜插入的GLUT4。這一現(xiàn)象可能是因?yàn)镚LUT4在內(nèi)體同時存在不同的抗原決定部位。在成肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，100 nmol/L渥曼青霉素可以抑制IA家族PI3激酶活性，同時卻出現(xiàn)胰島素誘導(dǎo)的GLUT4在細(xì)胞膜周圍大量堆積〔13〕。但是這些GLUT4第一胞外環(huán)結(jié)構(gòu)被改變，阻止細(xì)胞外周myc或HA抗原決定簇對其識別。經(jīng)渥曼青霉素和胰島素預(yù)處理后的細(xì)胞，用電子顯微鏡也能看到含GLUT4的囊泡停留在細(xì)胞膜〔13〕。由于無論細(xì)胞是否受胰島素刺激，都沒有觀察到含GLUT4囊泡與細(xì)胞膜融合，這一結(jié)果表明含GLUT4囊泡與細(xì)胞膜融合需要IA 家族PI3激酶。在L6肌細(xì)胞，載體傳遞PI3激酶的主要產(chǎn)物PI(3,4,5)P3，引起含GLUT4囊泡與細(xì)胞膜融合〔5〕；PI3激酶下游蛋白激酶Akt/PKB的活性隨溫度從19℃到37℃變化而變化〔14〕，含GLUT4囊泡與細(xì)胞膜的融合現(xiàn)象也隨之發(fā)生變化。此外，另一個PI3激酶效應(yīng)器——PKC，通過與80K-H和Munc18c的復(fù)雜作用，提高VAMP2綁定在突觸前膜上的蛋白syntaxin4，完成對融合事件的調(diào)節(jié)。siRNA降低磷脂酶D1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)磷脂酶D1也調(diào)節(jié)含GLUT4囊泡與細(xì)胞膜的融合〔15〕。總而言之，PI3激酶IA和亞型相關(guān)蛋白與胰島素引發(fā)的含GLUT4囊泡與細(xì)胞膜的融合有關(guān)。

囊泡與膜的融合受(SNARE)蛋白調(diào)節(jié)。胰島素刺激引發(fā)細(xì)胞膜獲得GLUT4的過程可被SNAREs (VAMP)2(a v-SNARE)，syntaxin4和SNAP23(two t-SNAREs)阻止〔16〕。v-SNAREs VAMP3 或 VAMP7 沒有阻止這一過程〔1〕。有趣的是，VAMP2的干擾不會改變未受刺激靜息狀態(tài)下的細(xì)胞膜GLUT4水平。因?yàn)樵诿庖呒兓腉LUT4小室(可能是SC/GSV)發(fā)現(xiàn)VAMP2，說明持續(xù)再循環(huán)的GLUT4囊泡和胰島素動員的GLUT4囊泡可能有不同的v-SNARE補(bǔ)體促進(jìn)其在細(xì)胞膜的錨定和融合。

最近運(yùn)用全內(nèi)熒光反射技術(shù)研究大鼠脂肪細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，在距離細(xì)胞膜100 nmol/L以內(nèi)，胰島素可能通過錨定事件減緩GLUT4-GFP的移動。這些結(jié)論表明，在基礎(chǔ)狀態(tài)，GLUT4囊泡到達(dá)細(xì)胞膜，但是并沒有錨定。錨定/融合是受胰島素調(diào)節(jié)的〔17〕。實(shí)際上，出胞復(fù)合物，特別是Exo70，引導(dǎo)囊泡到與膜融合的精確位置。隨后，囊泡上的VAMP2與膜上的t-SNAREs syntaxin4和SNAP23形成SNARE復(fù)合物。Munc18c，Synip和Tomosyn與synatxin4綁定，抑制胰島素誘導(dǎo)的GLUT4與細(xì)胞膜融合〔18〕。這些蛋白可能受胰島素調(diào)節(jié)，而且Synip就是被At/PKB磷酸化，從而空出syntaxin4的〔18〕?？墒牵?Akt/PKB磷酸化丙氨酸殘基，使得適宜的Synip磷酸化被競爭，卻沒有阻止依賴胰島素的GLUT4在細(xì)胞表面的聚集。雖然如此，出現(xiàn)證據(jù)支持源自胰島素的信號對SNARE復(fù)合物能進(jìn)行有效調(diào)節(jié)，其機(jī)制值得進(jìn)一步的研究。

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