拉曼光譜在乳腺癌相關(guān)研究中的應(yīng)用

王心莉 韓 冰 路 璐 吳 迪 杜 燁 范志民 鄭 超 張海鵬

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院乳腺外科，吉林 長春 130021)

拉曼光譜分析技術(shù)是以拉曼效應(yīng)為基礎(chǔ)建立起來的分子結(jié)構(gòu)表征技術(shù)。由于拉曼光譜具有操作簡便、測定時間短、靈敏度高、無損傷等優(yōu)點(diǎn)，使其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中得到廣泛應(yīng)用。最近，由于拉曼光譜儀器的改良和數(shù)學(xué)方法在結(jié)果分析中的應(yīng)用，使拉曼光譜在腫瘤診斷及發(fā)生機(jī)制研究方面顯示出突出優(yōu)勢，成為新的研究熱點(diǎn)。

1 拉曼光譜在乳腺癌中的研究基礎(chǔ)

1.1乳腺微鈣化的拉曼光譜研究 早期的拉曼光譜應(yīng)用于乳腺癌診斷，主要針對于鈣化灶成分的鑒別。乳腺癌的鈣化主要分為兩類，以草酸鈣為主要成分的鈣化；磷酸鈣和碳酸鈣，以羥磷灰石為主要成分。草酸鈣最常見于乳腺良性疾病，較少見于乳腺癌，而磷酸鈣主要見于增生性疾病中，包括乳腺良、惡性疾病，但良性疾病形成的鈣化除了主要成分羥磷灰石以外含有比惡性鈣化更多的碳酸鹽，相比之下惡性鈣化成分更純，主要是羥磷灰石，而且惡性病變的鈣化往往還有更多的蛋白質(zhì)。

Haka等〔1〕應(yīng)用拉曼光譜對含有微鈣化灶的人乳腺病灶石蠟切片標(biāo)本進(jìn)行研究，檢測證實乳腺囊性增生導(dǎo)致的鈣化是典型的Ⅰ型鈣化，拉曼光譜峰值在912/cm，1 477/cm和1 632/cm；伴有導(dǎo)管癌的Ⅱ型鈣化拉曼光譜檢測發(fā)現(xiàn)并非純羥磷灰石(960/cm，948/cm，1 028/cm和1 061/cm，1 075/cm)還包含有蛋白質(zhì)(1 445/cm，1 650/cm)、苯丙氨酸(1 004/cm)和脂質(zhì)(1 130/cm，1 300/cm)，最為重要的是在960/cm峰增寬表明其中含有碳酸鈣。并且，該小組將主成分分析(PCA)與Logistic回歸相結(jié)合分析以Ⅱ型鈣化，結(jié)果該方法的敏感性和特異性分別是88%和93%。但是實驗采用的是石蠟固定后的組織，而非新鮮組織。固定后標(biāo)本與新鮮標(biāo)本不同，這種固定后的標(biāo)本拉曼光譜檢測干擾較多，不利于結(jié)果分析。

Saha等〔2〕采用便攜式拉曼光譜檢測159例新鮮乳腺穿刺活檢組織，其中組織中的Ⅰ類鈣化即草酸鈣的峰值位于912和1 477/cm，Ⅱ類鈣化即羥磷灰石的峰值主要位于960/cm；并且在約2 150 μm深處的新鮮乳腺組織中檢測到了微鈣化。同時根據(jù)提供組織形態(tài)學(xué)信息和化學(xué)組成的特征峰的出現(xiàn)與否建立了適合系數(shù)(FC)模型，并計算出這個模型對于不同組織的變異系數(shù)，其中正常乳腺組織的變異系數(shù)為0.03，不伴有微鈣化的乳腺病變組織為0.12，伴有微鈣化的為0.22。

1.2單個細(xì)胞的研究 針對單個細(xì)胞的研究所對應(yīng)的光譜較乳腺組織檢測結(jié)果相對簡單，便于分析，對構(gòu)成細(xì)胞的3個主要成分核酸、蛋白質(zhì)和脂肪光譜學(xué)改變有一定認(rèn)識。

研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞DNA的磷酸骨架峰782、810/cm完全消失，1 084/cm的譜線明顯減少和脫氧核糖-磷酸振動峰1 155及1 262/cm拉曼譜線也明顯減少，表征DNA構(gòu)象的特征峰812/cm及譜線979 668/cm消失，并有新峰1 175/cm出現(xiàn)，905/cm的譜線增強(qiáng)并有6/cm的紅移，可能說明DNA的磷酸根骨架有一定的斷裂，導(dǎo)致癌細(xì)胞的分裂繁殖失去有效的控制〔3〕。Yu等〔4〕測試了正常細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中DNA的拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞的DNA擬合系數(shù)高于正常細(xì)胞，而RNA的擬合系數(shù)則無明顯變化。Zoladek等〔5〕通過共聚焦顯微拉曼光譜儀分析了人乳腺癌(MDA-MB-231)細(xì)胞在細(xì)胞凋亡過程中最初6 h的時間進(jìn)程光譜圖像，結(jié)果表明由于DNA縮合在凋亡細(xì)胞中DNA拉曼光譜帶信號強(qiáng)度增強(qiáng)；將來這種技術(shù)可能會成為體外毒理學(xué)研究和測試新藥物的一種工具。蛋白質(zhì)在正常乳腺細(xì)胞和癌細(xì)胞中的拉曼光譜特征還存在爭議。有人認(rèn)為癌細(xì)胞與正常細(xì)胞在1 658、1 300、1 262、1 002和852/cm的拉曼譜線沒有多大區(qū)別，可能說明癌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上并沒有發(fā)生明顯的改變。但謝裕安等〔6〕測量人正常上皮乳腺細(xì)胞株(HBL-100)和乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)的單細(xì)胞拉曼光譜時則得出與之不同的結(jié)果，該結(jié)果表明乳腺癌細(xì)胞的譜線強(qiáng)度整體變強(qiáng)，乳腺癌細(xì)胞的光譜中蛋白質(zhì)的歸屬峰936、1 002和1 445/cm及脂類的歸屬峰1 298/cm的峰高比正常乳腺細(xì)胞的升高。

另外在針對單個細(xì)胞的研究中，乳腺癌細(xì)胞的特征性受體(Her-2)也有研究報道。Hartsuiker等〔7〕采用共焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)檢測化學(xué)成分單一的MDA-MB-231，MDA-MB-435s及SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)與Her-2表達(dá)陽性的SK-BR-3細(xì)胞相比，Her-2表達(dá)陰性的MDA-MB-231細(xì)胞中脂類含量增加而飽和脂肪酸含量降低；同時，在MDA-MB這類具有高度轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞系中，多不飽和脂肪酸的含量增加。Yang等〔8〕利用p-對巰基苯甲酸介導(dǎo)的抗Her-2抗體共軛銀納米粒子作為表面增強(qiáng)拉曼的探針來檢測Her-2陽性乳腺癌SKBR3細(xì)胞株及Her-2陰性乳腺癌MCF7細(xì)胞株。實驗結(jié)果顯示，SKBR3細(xì)胞表現(xiàn)出比MCF7細(xì)胞更強(qiáng)大的SERS信號，表明該探針可能會用來區(qū)分不同乳腺癌細(xì)胞的HER2狀態(tài)。這種SERS探針制作簡單、檢測迅速、且具有高SERS敏感性和生物相容性，可以避免傳統(tǒng)免疫組織化學(xué)和熒光原位雜交兩種檢測方法費(fèi)用巨大時間持久的缺點(diǎn)，而且有可能直接檢測活體細(xì)胞或組織。

1.3針對血清的拉曼光譜研究 很多研究試圖通過檢測乳腺癌患者血清來診斷乳腺癌。正常人血清在固定波長的激發(fā)強(qiáng)度與癌癥患者有差異〔9〕，還有研究發(fā)現(xiàn)在某些特定波數(shù)癌癥患者與正常人有差異〔10〕，但僅僅是差異觀察尚不足以證明這種差異。Piehardo-Molina〔11〕、郭麗等〔12〕通過測試11例乳腺癌和12例健康人血清的拉曼光譜，并用主成分分析PCA和線性判別分析LDA方法研究了實驗組與對照組的拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)PCA可以使在不同的波段找出對照組和實驗組的差別，可能說明血清的拉曼光譜檢測可以用于診斷乳腺癌。

1.4乳腺組織切片的拉曼光譜研究 對于診斷乳腺癌，主要研究對象還是病變組織。最容易獲得的標(biāo)本是石蠟和冰凍切片，研究早期相關(guān)報道較多。姚淑霞等〔13〕采用激光共焦顯微拉曼光譜議對乳腺癌的病理切片及乳腺良性腫瘤的病理切片進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核上的拉曼峰較其他位置明顯，癌變組織860/cm處的拉曼峰明顯藍(lán)移；1 610/cm處的峰值與1 525/cm處的峰值比反映了病變與正常乳腺組織之間光譜的差異，并提出了以1 610/cm/1 525/cm是否>1.015作為判斷乳腺組織是否癌變的標(biāo)準(zhǔn)。但是這種組織切片由于經(jīng)過了處理，對拉曼光譜結(jié)果有很大影響。馮春霞等〔14〕對40例新鮮腫瘤組織及腫瘤組織冰凍切片的拉曼光譜進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，激發(fā)光源、樣品形態(tài)、切片厚度、離體時間、保存條件等因素對腫瘤組織拉曼光譜的采集會造成一定的影響。只有選擇合理的參數(shù)設(shè)置和處理方法，才可能獲得理想的拉曼光譜。Faolain等〔15〕比較全面地研究了冰凍、甲醛固定、石蠟包埋和脫蠟對組織拉曼光譜的影響，發(fā)現(xiàn)由于冰凍和甲醛固定而出現(xiàn)了新峰，同時氨基化合物波段出現(xiàn)了漂移。因此，采用新鮮組織的研究逐漸取代了對于組織切片的研究。

2 拉曼光譜的臨床研究

2.1手術(shù)切緣陽性檢測 Haka等〔16〕首次將拉曼光譜儀用于體內(nèi)乳腺組織的拉曼光譜收集，從9例接受部分乳房切除手術(shù)的患者乳腺組織殘腔內(nèi)的切緣表面收集了30個拉曼光譜，運(yùn)用先前體外實驗所建立的拉曼診斷模型計算這些拉曼光譜并與病理學(xué)結(jié)果相比較，該拉曼診斷模型結(jié)果的總體準(zhǔn)確率為93%(28/30)。該實驗初步表明了用拉曼光譜評估術(shù)中乳腺切緣的可行性。

Keller等〔17〕設(shè)計了一個具有多重偏移探測器的空間位移拉曼光譜探針用來檢測35例新鮮冰凍乳腺組織樣品，其中13例沒有腫瘤組織樣品及2例含有腫瘤但是腫瘤距離所測量樣品表面的最近距離>2 mm的組織樣品被標(biāo)記為“陰性切緣”；其他15例含有乳腺浸潤性導(dǎo)管癥(IDC)及5例含有乳腺浸潤性小葉癌(ILC)的組織樣品(腫瘤距離所測量樣品表面的最近距離<2 mm)被標(biāo)記為“陽性切緣”。由每個探測器所檢測的平均光譜創(chuàng)建出一個復(fù)合譜，這個復(fù)合譜含有組織表面到組織表面下2 mm內(nèi)所有的生化信息。采用稀疏多項式邏輯回歸分析方法將這些復(fù)合譜區(qū)分為陽性或陰性，然后與這些組織的病理學(xué)結(jié)果相比較而得出該方法的靈敏度為95%、特異度為100%。到目前為止，國內(nèi)外文獻(xiàn)尚沒有對取樣速度、樣品體積等與實驗方法密切相關(guān)的方面的闡述，同時診斷的準(zhǔn)確性也需要大量的臨床病例證實。

2.2乳腺腋窩淋巴結(jié)的拉曼光譜研究 拉曼光譜研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移主要是希望將其應(yīng)用于前哨淋巴結(jié)活檢。Horsnell等〔18〕采用拉曼光譜檢測38例IDC患者的腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)，所檢測的數(shù)據(jù)用PCA方法分析后與病理學(xué)結(jié)果比較，結(jié)果表明該方法在鑒別正常與轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)時，其靈敏度高達(dá)92%，特異性為100%。Sattlecker等〔19〕詳細(xì)分析了拉曼光譜與多元統(tǒng)計分析方法相結(jié)合來評估乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)的準(zhǔn)確性，采用拉曼光譜檢測43例乳腺癌患者的腋窩淋巴結(jié)，所獲得的拉曼光譜數(shù)據(jù)集來構(gòu)建不同類型的支持向量機(jī)(SVM)模型，包括線性、多項式和徑向基函數(shù)(RBF)，并與傳統(tǒng)的化學(xué)計量學(xué)方法：線性判別分析(LDA)模型和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型相對比，結(jié)果表明RBF-SVM模型具有高達(dá)100%的分類精度，顯示了其在應(yīng)用于臨床診斷方面的巨大潛力。

拉曼成像技術(shù)〔20〕最早用來評估前哨淋巴結(jié)狀態(tài)并區(qū)分其陰陽性時被證實具有91%的靈敏度和93%的特異性。陽性及陰性淋巴結(jié)組各平均光譜分析結(jié)果表明，與陰性淋巴結(jié)相比，陽性淋巴結(jié)的DNA及酪氨酸波峰增強(qiáng)而膠原蛋白波峰降低。然而為了精確的測量繪制該拉曼圖像，需要12～120 h的測量以獲得足夠數(shù)量的拉曼光譜，這一缺點(diǎn)限制了拉曼成像技術(shù)在術(shù)中的應(yīng)用。Horsnell等〔21〕設(shè)計了一個探測器模型以較少的拉曼特征光譜評估淋巴結(jié)狀態(tài)，從而實現(xiàn)在期限時間內(nèi)快速診斷。實驗結(jié)果表明該拉曼檢測系統(tǒng)用于臨床術(shù)中評估腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)的可行性。

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