miRNA對衰老調(diào)控的相關(guān)研究進(jìn)展

宓 林 于曉峰 鄒 健

(復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200040)

衰老(aging)是每一個有機(jī)體都必須經(jīng)歷的復(fù)雜過程，隨著時間的推移，眾多器官功能逐漸衰退。即使是在組織中具有替換損傷細(xì)胞功能的干細(xì)胞(stem cells)，長時間暴露于有害的環(huán)境或內(nèi)源性毒素中，也將導(dǎo)致細(xì)胞不斷損傷或衰退。一旦替換與損失之間的平衡被打破，機(jī)體就會出現(xiàn)功能紊亂從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。隨著衰老的進(jìn)一步發(fā)展，機(jī)體內(nèi)的慢性環(huán)境容易導(dǎo)致神經(jīng)退行性變、糖尿病、骨關(guān)節(jié)退行性變及甚至腫瘤的發(fā)生。因此，深入認(rèn)識并了解衰老機(jī)制將有助于削弱甚至攻克這一普遍存在的現(xiàn)象給人類帶來的巨大影響。

1 研究背景

基因表達(dá)水平的改變決定生長發(fā)育中的組織分化，并與衰老中的機(jī)體器官、組織、細(xì)胞等功能下降有關(guān)。有機(jī)體的生長過程是被緊密調(diào)控的，而我們對生長發(fā)育與衰老之間的轉(zhuǎn)變以及機(jī)體發(fā)育后改變的調(diào)控，同樣都不甚了解。通過測定人和恒河猴生存期中額葉前皮質(zhì)mRNA、miRNA及蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)僅少數(shù)基因表達(dá)的改變對衰老具有特異性，而衰老過程中多數(shù)miRNA和基因表達(dá)改變表現(xiàn)為發(fā)育模式的反轉(zhuǎn)或延續(xù)。研究顯示miRNA及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控了整個生存期中多數(shù)可調(diào)控進(jìn)程的發(fā)育及發(fā)育后的表達(dá)改變。相應(yīng)基因組區(qū)的差異性進(jìn)化守恒提示這些調(diào)控進(jìn)程對于發(fā)育而言也許是有利的，而對于衰老而言則可能是相對不利的。實驗結(jié)果顯示衰老過程中生長發(fā)育的調(diào)控及表達(dá)改變是有直接關(guān)系的〔1〕。與細(xì)胞增殖、靜止、凋亡及分化等相類似，細(xì)胞的衰老是由特定的基因表達(dá)程序所緊密調(diào)控的?；蛘{(diào)控的衰老中含有重要的轉(zhuǎn)錄成分，包括p53、AP-1、E2F、Id及Ets在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子。近年來還發(fā)現(xiàn)了兩組關(guān)于衰老的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要作用因子，第一組含與靶mRNAs相關(guān)的編碼衰老的因子及影響細(xì)胞衰老的RNA結(jié)合蛋白(PBP)，如人抗原R(HuR)、AU結(jié)合因子(AUF1)、TTP。第二組含微小RNA(MicroRNA，miRNA)，這是一類廣泛存在的非蛋白編碼的小分子RNA，長度約為19-25nt，主要通過與靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)合成從而調(diào)控基因的表達(dá)。在細(xì)胞核內(nèi)，miRNA的編碼基因在RNA轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成初級轉(zhuǎn)錄體pri-miRNA，然后pri-miRNA 在RNase III，Drosha的作用下，剪切為具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA 前體(pre-miRNA)，接著由依賴Ran 和轉(zhuǎn)運(yùn)受體家族成員輸出蛋白-5(Exportin-5)將pre-miRNA 從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)。pre-miRNA 在細(xì)胞質(zhì)中由RNA 酶III(Dicer)進(jìn)一步切割而產(chǎn)生成熟的miRNA。MiRNAs通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)進(jìn)而參與調(diào)控一系列的生命活動，包括細(xì)胞增殖、生長發(fā)育、器官形成、造血、凋亡、腫瘤的發(fā)生。現(xiàn)在人們越來越深刻地認(rèn)識到miRNA對基因表達(dá)調(diào)控的有力作用，在識別衰老調(diào)控相關(guān)的miRNAs方面具有積極的作用。自2007年以來，全球掀起了一陣關(guān)于研究在衰老過程中具有差異表達(dá)的miRNAs的熱潮，并進(jìn)一步開展其在衰老表型方面作用的深入研究，證實miRNAs能通過多種途徑影響特定的衰老過程。

2 MiRNAs在衰老中的主要作用機(jī)制

2.1MiRNAs與p53/p21衰老通路 P53在衰老及老化過程中起核心作用，其在控制衰老調(diào)控的miRNA表達(dá)中也具有一定影響。2007年有研究發(fā)現(xiàn)miR-34能觸發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞及人二倍體成纖維細(xì)胞(HDFs)的衰老〔2,3〕。在復(fù)制衰老的纖維母細(xì)胞中，miR-34a的表達(dá)隨著p53的改變而增多，miR-34家族可以從生長停滯及凋亡等方面影響p53的活性。目前有越來越多的經(jīng)miR-34a作用而抑制的mRNAs已被識別，如編碼E2F、c-Myc、SIRT1、Cdk4、Cdk6、Bcl-2、肝細(xì)胞生長因子受體(Met)及cyclins D1和E2的mRNAs，從而得出結(jié)論：miR-34a是一個已明確的抑癌因子并具有觸發(fā)衰老的作用。MiR-34a在p53非依賴方式中呈現(xiàn)上調(diào)態(tài)勢，在由Braf所觸發(fā)的HDF衰老中miR-34a通過轉(zhuǎn)錄因子Elk1作用而上調(diào)，在粒細(xì)胞衰老過程中主要是經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)結(jié)合蛋白(C/EBP)a作用而上調(diào)，在過氧化氫誘導(dǎo)的早衰過程中同樣觀察到miR-34水平的上調(diào)。MiR-34抑制腫瘤的作用與其啟動衰老的機(jī)制是相一致的，過甲基化的miR-34a在許多不同腫瘤細(xì)胞類型中呈現(xiàn)出致癌性的改變，如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及腎癌〔4〕。提高miR-34a的水平不僅能夠抑制腫瘤的發(fā)生，并且與SIRT1的表達(dá)下降以及可能導(dǎo)致動脈粥樣硬化的抑制細(xì)胞增殖相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老有關(guān)。在衰老的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)中miR-34a表達(dá)水平的升高能減少SIRT1的產(chǎn)物及EPC介導(dǎo)的血管生成。有研究分析了非人靈長類動物恒河猴大腦皮層神經(jīng)元及大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元中特定miRNA分子- miR34a的表達(dá)特性及作用，發(fā)現(xiàn)其隨著年齡梯度增長而呈現(xiàn)表達(dá)增加的規(guī)律：在過表達(dá)miR-34a的情況下，它可能通過抑制BCL-2而引起神經(jīng)元的凋亡，提示miR-34a可能參與神經(jīng)元的發(fā)育與衰老過程〔5〕。在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、動脈內(nèi)皮細(xì)胞及人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞中，miR-217同樣能降低SIRT1的表達(dá)，從而引起早衰和血管損傷的發(fā)生。最近發(fā)現(xiàn)miR-885-5p在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的過表達(dá)可以觸發(fā)細(xì)胞衰老，盡管其中CDK2及MCM5的mRNAs是直接作用靶點(diǎn)，但miR-885-5p能同時有力的激活p53通路并誘導(dǎo)p53調(diào)控基因〔6〕。

P21在應(yīng)激及癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型中是多個miRNAs的作用靶點(diǎn)。P21是廣譜的cdk抑制因子，其表達(dá)受miRNAs中的miR-106家族及其他人乳腺上皮細(xì)胞中具有相似種子序列的如miR-130b,miR-302a-d,miR-512-3p及miR-515-3p所抑制。在該模型系統(tǒng)中，p21是誘導(dǎo)衰老過程所必須的，而降低p21的表達(dá)則可以從RasV12誘導(dǎo)的衰老過程中拯救細(xì)胞，衰老的HDFs及HTM細(xì)胞中高水平表達(dá)的p21可以降低miR-106b的水平。較少量的miR-15家族成員可以促進(jìn)Bcl-2的積聚，與衰老細(xì)胞增強(qiáng)的抗凋亡能力相一致。

2.2MiRNAs調(diào)節(jié)p16/RB通路 另一組日漸受到關(guān)注的調(diào)控衰老的miRNA主要作用于細(xì)胞分裂周期，尤其是經(jīng)RB通路。RB通路與p53通路是緊密相關(guān)的，其功能明顯受cdk活性所控制。P16與p21相同，是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKI)，p16是Cdk4及Cdk6的抑制因子，繼而抑制pRb的磷酸化而維持其活性形式，在增殖所需的轉(zhuǎn)錄基因中阻斷E2F。p16的翻譯過程受HDFs中的miR-24所抑制。盡管增殖期的HDFs表達(dá)高水平的miR-24從而導(dǎo)致p16的低表達(dá)，晚期HDFs表達(dá)低水平的miR-24而產(chǎn)生高水平表達(dá)的p16，而單純的miR-24異常過表達(dá)并不能阻止衰老的發(fā)展，同樣，單純的異?？筸iR-24表達(dá)也并不能加速衰老發(fā)展，可能是因為miR-24同時也能降低許多增殖蛋白的表達(dá)。有研究顯示E2F1負(fù)反饋回路下游的miR-449a及miR-449b能直接相互激活miR-449a/b的轉(zhuǎn)錄，從而定位并抑制CDK6及CDC25A，并進(jìn)一步導(dǎo)致pRb過甲基化使細(xì)胞停滯于G1期〔7〕，MiR-24只有在和其他miRNAs(miR-15b,miR-25,miR-141)相聯(lián)合的情況下才能起強(qiáng)化衰老的作用。而MiR-34能抑制cyclin D1及Cdk6的表達(dá)。

2.3MiRNAs與胰島素/胰島素樣生長因子(IGF)通路 已明確IGF通路是調(diào)控信號通路，在蛋白質(zhì)合成和血糖穩(wěn)定中起重要作用。損傷IGF通路功能或引起其表達(dá)下降的突變能夠延長C. elegans、果蠅、FIRCO鼠甚至人類的壽命。這些從低等生物體中實驗得出的證據(jù)顯示出miRNA在調(diào)節(jié)IGF通路中的重要性。Lin-4基因及其靶點(diǎn)lin-14共同調(diào)控C. elegans的壽命，由lin-14下降所引起的壽命延長需依賴2個轉(zhuǎn)錄因子：DAF-16和HSF-1。DAF-16是DAF-2下游的作用靶點(diǎn)，是C. elegans內(nèi)一些胰島素樣多肽的一般受體，由此提示lin-4和lin-14參與調(diào)控IGF-1信號通路。一些研究報道有很多miRNAs共同參與調(diào)控IGF信號通路，尤其是miR-1可以與IGF-1的3'UTR部分結(jié)合而參與調(diào)控過程〔8,9〕。MiR-1在骨骼肌及心肌中呈特異性表達(dá)，并參與心臟的發(fā)育、心肌梗死、心臟干細(xì)胞分化及心律失常，并同時研究了其在心肌中的作用。與miR-1相同，miR-320和miR-206在心肌細(xì)胞中也能靶向結(jié)合IGF-1。MiR-145可以靶向結(jié)合1型胰島素樣生長因子受體(IGF-1R)及胰島素受體底物-1(IRS-1)，IRS-1是IGF-1R的對接蛋白。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-5(IGFBP-5)是miR-140的直接靶點(diǎn)，通過p53依賴機(jī)制與細(xì)胞衰老相關(guān)聯(lián)。而let-7a3與IGF2及IGFBP3蛋白水平反相關(guān)。脂代謝和胰島素分泌也可分別被miR-122及miR-375所調(diào)控，IGF-1信號同樣與SIRT1、白藜蘆醇通路調(diào)控機(jī)體壽命相關(guān)，有趣的是miR-217在衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中的抑制可以通過增加SIRT1的活性而減少衰老細(xì)胞的比率。

2.4MiRNAs與TOR通路 TOR是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，雖然2種TOR蛋白(TOR1和TOR2)在酵母體內(nèi)具有相似的控制細(xì)胞生長的功能，而哺乳動物體內(nèi)的mTOR則有2個功能不同的復(fù)合物(TORC1和TORC2)。TORC1磷酸化S6K及4E-BP1從而促進(jìn)翻譯過程，而TORC2則控制細(xì)胞骨架的肌動蛋白。TOR通路集中作用于3方面控制細(xì)胞生長：分別為營養(yǎng)的有效性、能量狀態(tài)及生長因子。TOR信號通路作為營養(yǎng)感受器與胰島素/IGF信號通路相關(guān)聯(lián)是合理的。由生長因子(胰島素或IGF)觸發(fā)后，信號轉(zhuǎn)換至AKT/PKB(蛋白激酶B)從而抑制結(jié)節(jié)性硬化蛋白1/2(TSC1/TSC2)的功能，轉(zhuǎn)而促進(jìn)TORC1和TORC2的激活。在許多有機(jī)體中限制卡路里攝入可以延長壽命，由此進(jìn)一步了解關(guān)于調(diào)控營養(yǎng)感受及生理反應(yīng)的通路之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。TOR通路與胰島素/IGF信號相互作用，功能缺失的猛禽突變C. elegans及TOR同源序列，daf-15、let-363的研究發(fā)現(xiàn)其與衰老相關(guān)，并能明顯延長壽命〔10〕。TOR通路可能是由于其負(fù)性調(diào)控自體吞噬的作用而對延長壽命方面產(chǎn)生影響。有研究報道m(xù)iR-100的過表達(dá)會抑制mTOR的mRNA及蛋白水平，但仍缺乏直接相關(guān)的證據(jù)〔11〕。MiR-21是由TOR和NFκB調(diào)控的，miR-30a靶向結(jié)合beclin-1并進(jìn)而抑制自體吞噬，從而提示其可能與TOR通路具有相關(guān)性。

2.5MiRNAs調(diào)節(jié)SASP相關(guān)通路 SASP具有分泌多種生長因子、ECM降解酶及細(xì)胞因子的特點(diǎn)，后者中包括2種關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)，IL-6和IL-8。有研究報道在HDFs中，miR-146a/b降低IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)的表達(dá)，IRAK1是IL-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵組成部分。通過IRAK阻斷IL-6和IL-8的分泌而降低信號可以避開SASP〔12〕。長期培養(yǎng)的BJ纖維母細(xì)胞異常過表達(dá)端粒酶活性，且miR-146a的表達(dá)水平升高，提示SASP的調(diào)控可能與衰老有關(guān)〔13〕。整合蛋白β1是一種細(xì)胞表面蛋白，與ECM相互作用并影響HDF的衰老，miR-183在H2O2觸發(fā)的衰老中能減少其表達(dá)。Let-7靶向結(jié)合蠕蟲的細(xì)胞核受體DAF-12，DAF-12與脊椎動物的維生素D及肝X受體相關(guān)，DAF-12通過消除生殖細(xì)胞系的類固醇而介導(dǎo)壽命延長過程。在C. elegans中，類固醇信號也能調(diào)節(jié)D. melanogaster的壽命，其中類固醇是蛻化素，miR-14可與蛻化素受體靶向結(jié)合，提示其調(diào)節(jié)壽命的可能性。

3 小 結(jié)

離體培養(yǎng)的細(xì)胞中miRNAs對衰老的影響已逐步為人們所了解，而miRNAs在體內(nèi)對于衰老及衰老調(diào)控的過程仍有待進(jìn)一步探索。例如評估顯示，腫瘤細(xì)胞中的miR-34a的水平在原發(fā)性黑色素瘤樣本中，miR-34a的啟動子CpG發(fā)生甲基化〔4〕，與黑色素瘤中miR-34a的較低轉(zhuǎn)錄相一致，提示p53能上調(diào)體內(nèi)miR-34a的產(chǎn)物，更進(jìn)一步支持miR-34a能在體內(nèi)誘導(dǎo)衰老的觀點(diǎn)，用于研究該過程的遺傳模型最近得到一定的發(fā)展。MiRNA合成酶Dicer等位基因缺失的模型鼠表現(xiàn)出胚胎致死性，由此研究出一種Dicer條件缺失鼠，消除MEFs中的Dicer能觸發(fā)生長停滯相關(guān)的早衰表型，上調(diào)Arf(通過阻斷泛素介導(dǎo)的p53降解而使p53增多)，高表達(dá)的p53及p21能增加SAHF和SA-βgal的活性，當(dāng)Dicer條件鼠與ARF/p16-null鼠或p53-null鼠雜交后，消除Dicer使生成的MEFs不發(fā)生衰老，提示損傷的miRNA的生物轉(zhuǎn)化是通過Arf/p16和p53依賴通路從而啟動衰老過程〔14〕，HDFs中下調(diào)的Dicer同樣能誘導(dǎo)衰老的發(fā)生。

過去10年間人們對細(xì)胞衰老的觸發(fā)、標(biāo)志及影響有了一定的認(rèn)識，并深刻了解到機(jī)體內(nèi)的衰老是多種生理及病理過程的基礎(chǔ)，不僅僅是在腫瘤方面，同時也表現(xiàn)在動脈粥樣硬化、糖尿病、肌肉減少征、神經(jīng)退行性變、心血管及呼吸系統(tǒng)疾病等多方面。MiR-22在老化心臟中表達(dá)上調(diào)，可能加速成心肌細(xì)胞衰老并增加其遷移活性，與心臟纖維化等增齡相關(guān)的心臟改變相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)軟骨組織中miR-199a-3p、miR-193b的表達(dá)隨衰老而呈現(xiàn)上調(diào)，而miR-320c則隨老化而呈現(xiàn)下調(diào)，由此推測miR-199a-3p及miR-193b與軟骨細(xì)胞的衰老相關(guān)，而miR-320c則與軟骨細(xì)胞幼稚態(tài)相關(guān)〔15〕。在年輕的HUVECs中，miR-146a通過直接作用于NOX4蛋白而影響早熟老化樣表型，從而與細(xì)胞衰老與老化相關(guān)聯(lián)。通過比較人類、黑猩猩、恒河猴大腦皮層及小腦中增齡相關(guān)的miRNA表達(dá)水平差異，發(fā)現(xiàn)抑制miR-144表達(dá)會增加人體細(xì)胞中ATXN1水平〔16〕。在過去5年中證實了miRNAs是衰老過程的關(guān)鍵調(diào)控因素，在衰老的很多方面起到重要的作用，miRNAs能調(diào)節(jié)衰老相關(guān)的諸多重要過程?；罨腜53能增加miR-34a的轉(zhuǎn)錄，miR-34和p21是很多衰老調(diào)控蛋白的抑制因子，許多miRNAs在減少p21及p16表達(dá)水平的同時也減少了衰老細(xì)胞的數(shù)量，而p21和p16的增多可以抑制cdks并激活RB。衰老細(xì)胞同時表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后因子水平的改變，其中有些能影響p53/p21及p16/RB衰老通路中的關(guān)鍵蛋白。以上三組蛋白共同作用時能夠停止細(xì)胞周期的進(jìn)程并明顯改變衰老相關(guān)的基因表達(dá)程序。MiRNAs還能促進(jìn)SASP而增加IL-6、IL-8的分泌，轉(zhuǎn)而促進(jìn)局部及整體的炎癥反應(yīng)，減少ECM的完整性。

近年來我國對miRNA在衰老中的作用也開展了一系列工作，研究發(fā)現(xiàn)使let-7a沉默可上調(diào)p66Shc蛋白表達(dá)水平，過表達(dá)let-7a則下調(diào)p66Shc蛋白表達(dá)水平，但無論let-7a的過表達(dá)或沉默均不影響P66Shc mRNA水平。let-7a對P66Shc翻譯的調(diào)控機(jī)制在于前者可影響后者在多核糖體及p-body的分布水平。在人二倍體成纖維細(xì)胞(2BS細(xì)胞)衰老過程中，let-7a隨細(xì)胞衰老而降低，P66Shc蛋白水平則隨細(xì)胞衰老而升高。然而，細(xì)胞衰老過程中P66Shc mRNA水平并無明顯改變，提示細(xì)胞衰老過程中P66Shc表達(dá)上調(diào)主要是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的結(jié)果。沉默P66Shc可延緩細(xì)胞衰老，延長細(xì)胞壽限(life-span)，過表達(dá)let-7a也可通過下調(diào)P66Shc其到類似效果。相反，沉默let-7a則上調(diào)P66Shc、加速細(xì)胞衰老、縮短細(xì)胞壽限〔17〕。MiR-107在細(xì)胞衰老中起著重要作用，可能是通過脂代謝異常途徑導(dǎo)致細(xì)胞衰老〔18〕。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)作為細(xì)胞衰老調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，許多miRNA與衰老及衰老相關(guān)的疾病有關(guān)，已有明確的證據(jù)表明在衰老過程中表達(dá)上調(diào)的miRNA有miR-138、miR-152、miR-410、miR-431和miR-493等，而表達(dá)下調(diào)的miRNA有miR-15A、miR-20A、miR-25和miR-155等〔19〕。

盡管目前對于miRNAs在衰老中對基因表達(dá)影響的認(rèn)識逐漸深入，但對于衰老改變miRNA水平的機(jī)制仍所知甚少。目睹了體內(nèi)衰老及miRNA控制衰老的相互作用后，一系列新挑戰(zhàn)及新問題呈現(xiàn)在我們面前：MiRNAs如何在機(jī)體內(nèi)影響衰老過程?哪些控制衰老的miRNAs在維持生理平衡狀態(tài)中是必須的?哪些miRNA調(diào)節(jié)了異常衰老過程中的病理生理?這些miRNAs是如何在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平中被調(diào)控的？是否能通過增減miRNAs而調(diào)節(jié)衰老進(jìn)程以達(dá)到治療的目地?要回答這些問題必須從組織、器官及機(jī)體的層面充分了解體內(nèi)衰老的過程，為達(dá)到該目標(biāo)還必須識別普遍適用的，具有特異性且敏感度高的機(jī)體衰老細(xì)胞標(biāo)記物。使用動物模型也有助于研究衰老細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)、分子學(xué)、基因?qū)W及生化特性。衰老調(diào)控的miRNAs在動物模型體內(nèi)已有了一定的了解，相比較而言在人體內(nèi)的相關(guān)實驗相對較少，就目前階段而言要充分了解衰老miRNAs在生理相關(guān)情況下的影響尚有一定困難。更加全面地了解特異性miRNAs在衰老中的作用，同樣能夠使以miRNA為基礎(chǔ)而干預(yù)衰老相關(guān)病理改變的治療手段成為可能。MiRNAs是有力的分子工具及靶點(diǎn)，是在重建年齡相關(guān)的機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)損傷中尤為顯著。

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