腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型的現(xiàn)代研究進(jìn)展

張 琰 鄧樹泳 馬 娜 邢德剛

(廣東藥學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510006)

腎陽(yáng)虛是腎陽(yáng)虛弱，溫煦無力，氣化失常，陰寒內(nèi)生，并使性與生殖能力減退的病理變化。腎陽(yáng)虛即意味著人體生命活動(dòng)機(jī)能的衰退與減弱，臨床以腰膝酸軟、畏寒肢冷、陽(yáng)痿早泄等為主要表現(xiàn)的證侯。常見于哮喘、泄瀉、虛勞、水腫、癃閉、陽(yáng)痿、帶下，以及西醫(yī)的慢性腎炎、慢性腎衰竭、慢性腸炎、腎上腺皮質(zhì)機(jī)能減退、慢性心衰等疾病。建立有效的動(dòng)物模型是腎陽(yáng)虛證研究工作中不可缺少的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

1 激素造模法

1.1糖皮質(zhì)激素 腎陽(yáng)虛造模方式主要分病理造模和病因造模,且以病理造模多見。糖皮質(zhì)激素造模是病理造模應(yīng)用最廣泛的造模方法。大量的實(shí)驗(yàn)研究觀察了皮質(zhì)激素腎陽(yáng)虛模型幾乎全身所有系統(tǒng)的變化。包括模型機(jī)體代謝水平下降,免疫功能下降,廣泛的器官病理?yè)p害,中樞神經(jīng)系統(tǒng)和自然神經(jīng)系統(tǒng)功能的改變,體內(nèi)各種激素含量、脂質(zhì)過氧化物的增加和自由基清除系統(tǒng)功能的低下,血細(xì)胞系統(tǒng)各種成分, 血液內(nèi)各種離子濃度,血循環(huán)流變學(xué)等方面都有不同程度的變化。糖皮質(zhì)激素造模其用藥及成模時(shí)間一直在變化。從開始的短效到長(zhǎng)效激素,從連續(xù)用藥到間歇用藥并且停藥,從1～2 w到30 d,從皮質(zhì)醇制劑到皮質(zhì)酮制劑。

糖皮質(zhì)激素造模氫化可的松應(yīng)用的最多,約占全部腎陽(yáng)虛模型的30%，可能是這樣的模型直觀、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便易行。該模型主要通過影響下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能，導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)外界環(huán)境變化的應(yīng)激、適應(yīng)能力下降，而出現(xiàn)陽(yáng)虛表現(xiàn)。動(dòng)物的生命活動(dòng)減弱、畏寒喜暖的表現(xiàn)也與腎陽(yáng)虛的表現(xiàn)一致〔1〕。最早建立的腎陽(yáng)虛模型是鄺安堃等〔2〕的氫化可的松動(dòng)物模型,實(shí)驗(yàn)用16～20 g雄性小白鼠，每日臀部肌肉注射醋酸皮質(zhì)素,大劑量0.5 mg/d，中劑量0.25 mg/d，結(jié)果兩組在不同時(shí)間均出現(xiàn)了一系列腎陽(yáng)虛表現(xiàn)，在合用助陽(yáng)藥時(shí)，動(dòng)物多不出現(xiàn)衰竭現(xiàn)象，或僅是輕度的虛弱，體重的減輕不甚明顯，與未合用助陽(yáng)藥的動(dòng)物顯然有別。此法后得到推崇與效仿。

沈自尹等〔3〕采用皮質(zhì)酮所致的大鼠腎陽(yáng)虛模型，測(cè)定不同配伍方式的淫羊藿總黃酮、知母總皂苷和甘草次酸及其組合物對(duì)腎臟和免疫功能的保護(hù)作用，結(jié)果表明，有滋陰、溫補(bǔ)腎陽(yáng)作用的中藥組合物能夠有效保護(hù)外源性皮質(zhì)激素作用下的腎臟和免疫功能，具有開發(fā)為新藥的潛力和應(yīng)用價(jià)值。

1.2雌二醇 以雄鼠肌注雌二醇的方法造成另一種腎虛模型,用以模擬臨床上老年男性雌雄激素改變的趨勢(shì)。苯甲酸雌二醇法能誘發(fā)大鼠小鼠下丘腦-垂體-性腺軸受抑制而造成腎陽(yáng)虛模型,動(dòng)物出現(xiàn)活動(dòng)能力減弱、抗疲勞功能下降等表現(xiàn)。呂圭源等〔4〕在觀察比較甘涼歸肝腎經(jīng)(女貞子、龜甲)與甘溫歸肝腎經(jīng)(海馬、菟絲子)中藥對(duì)雌二醇致小鼠腎陽(yáng)虛的影響時(shí)，將ICR雄性小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、金匱腎氣丸組、女貞子組、龜甲組、海馬組、菟絲子組。除正常對(duì)照組外，其余各組按10 ml/kg腹腔注射0.4 mg/ml的苯甲酸雌二醇大豆油稀釋液，1次/d，連續(xù)12 d，造成腎陽(yáng)虛模型。各給藥組按相應(yīng)劑量灌胃給藥，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等容積水，1次/d，連續(xù)12 d。

2 其他藥物造模法

2.1羥基脲法 羥基脲是一種核苷二磷酸還原酶抑制劑，可以阻止核苷酸還原為脫氧核苷酸，因而選擇性地抑制DNA的合成，并能直接損傷DNA，影響蛋白質(zhì)代謝，出現(xiàn)一系列腎虛癥狀。

楚生輝等〔5〕觀察七腎湯對(duì)羥基脲腎虛大鼠生育力的影響時(shí)，將雄、雌性大鼠隨機(jī)各取10只動(dòng)物作為正常組，其余大鼠給予羥基脲片500 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)30 d，造成雌、雄性生殖功能障礙大鼠模型，觀察七腎湯對(duì)雌性模型大鼠動(dòng)情周期變化，卵巢、子宮重量；雄性模型大鼠睪丸、附睪重量，精子密度與活率。

2.2腺嘌呤法 腺嘌呤是核酸的主要組成成分之一，當(dāng)機(jī)體攝入大劑量腺嘌呤時(shí)，異常高濃度的腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下則轉(zhuǎn)變成極難溶解于水的2,8-二羥基腺嘌呤，這種代謝產(chǎn)物沉積于腎小管，引起腎衰竭，腺嘌呤代謝產(chǎn)物不僅僅因機(jī)械性阻塞腎小管而引起腎衰竭，而且還可能由于腺嘌呤代謝產(chǎn)物毒性作用，使腎組織中與糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝有關(guān)的多種酶活性受抑制，影響了腎組織的能量代謝。邵命海等〔6〕用腺嘌呤誘導(dǎo)SD大鼠腎陽(yáng)虛模型并從腎主生殖的角度與氫化可的松誘導(dǎo)的腎陽(yáng)虛模型進(jìn)行比較。其方法為對(duì)氫化可的松低、中、高劑量組分別予肌肉注射氫化可的松0.5 mg/100 g,2 mg/100 g,5 mg/100 g，共2 w；腺嘌呤組予2%腺嘌呤混懸液2 ml灌胃4 w。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腺嘌呤制作的SD大鼠腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型睪丸萎縮，精曲小管退化變性，精囊萎縮，前列腺體明顯萎縮甚至消失，腎上腺皮質(zhì)變薄，以束狀帶萎縮明顯，睪酮水平偏低，這些變化較氫化可的松誘導(dǎo)組明顯。

2.3氨基導(dǎo)眠能法 氨基導(dǎo)眠能使類固醇激素合成受阻,造成垂體-腎上腺皮質(zhì)和垂體-性腺軸功能減退的陽(yáng)虛模型。用灌胃或口服氨基導(dǎo)眠能方法造成的模型具有腎上腺重量減輕,腎上腺皮質(zhì)萎縮,血漿皮質(zhì)醇減少,腎上腺組織cAMP水平降低等變化。蔡連香等〔7〕在實(shí)驗(yàn)中采用雌性新西蘭白兔,3～4月齡,1.6～2.4 kg,每天胃管投氨基導(dǎo)眠能6 mg/kg(用蒸餾水配成10 mg/ml混懸液),連續(xù)15 d。動(dòng)物表現(xiàn)為體重減輕,體溫下降,出現(xiàn)拱背穹起,毛發(fā)卷曲,稀疏而無光澤,攝食減少,對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍, 萎靡不振等。氨導(dǎo)所致模型家兔的表現(xiàn)兼?zhèn)淞岁?yáng)虛和腎虛證共有的癥狀,可用來探討補(bǔ)腎藥的作用機(jī)制。

2.4甲狀腺抑制藥物法 常用來造模的甲狀腺抑制藥物有丙基硫氧嘧啶，他巴唑和甲基硫氧嘧啶。

丙基硫氧嘧啶模型動(dòng)物T3、T4含量下降。模型中樞內(nèi)去甲腎上腺素含量無顯著變化。大腦皮層、海馬腎上腺素能β受體減少,腎上腺素能α1受體和小腦腎上腺素能β受體無顯著變化,反映出模型腦內(nèi)交感神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)減弱。盧德趙等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)腎陽(yáng)虛大鼠出現(xiàn)少飲少食、體質(zhì)量減輕、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少、拱背聳毛、毛色無光澤、易脫落，叫聲低弱等癥狀，而正常組大鼠表現(xiàn)如常。

他巴唑模型在已有的檢測(cè)項(xiàng)目中與丙基硫氧嘧啶動(dòng)物大體一致,另外模型血清中環(huán)磷酸腺苷(CGMP)含量的升高,血超氧化物歧化酶(SOD)減少,腦內(nèi)丙二醛含量增加,顯示造模有一定細(xì)胞毒性作用。模型還有胸腺、睪丸重量下降,模型肝、肌肉、垂體、心等存在不同程度的組化和病理改變。歐陽(yáng)軼等〔9〕用他巴唑建立SD大鼠腎陽(yáng)虛模型，觀察模型的體溫、體重變化及血清皮質(zhì)醇(CORT)、T3、T4、睪酮(T)/雌二醇(E2)等指標(biāo)，模型下丘腦-垂體-腎上腺軸、甲狀腺軸、性腺軸個(gè)軸的變化。認(rèn)為大鼠他巴唑模型可以出現(xiàn)明顯的體溫下降。血清T3、T4下降，而對(duì)腎上腺軸和性腺軸的干擾不明顯,只適用于甲狀腺功能低下的腎陽(yáng)虛證。

甲基硫氧嘧啶模型有睪丸、胃、十二指腸的病理改變,血漿皮質(zhì)醇含量減少。但與丙基硫氧嘧啶和他巴唑相比,甲基硫氧嘧啶的副作用最強(qiáng)。因此到底所觀察到的現(xiàn)象是腎陽(yáng)虛的表現(xiàn)抑或是藥物副作用,還有待鑒別。

3 手術(shù)造模法

手術(shù)造模是通過切除動(dòng)物腎上腺、甲狀腺、性腺等造成體內(nèi)激素水平下降，建立腎陽(yáng)虛模型。

腎上腺切除造模是通過腎上腺次全切除和雙側(cè)腎上腺全切造成腎上腺皮質(zhì)功能低下。以腎上腺切除法造成的模型使卵巢重量下降,雌激素受體解離常數(shù)上升；舌組織表現(xiàn)為營(yíng)養(yǎng)及代謝降低的病理變化與甲基硫氧嘧啶陽(yáng)虛動(dòng)物的表現(xiàn)一致。史念珂等〔10〕使用SD大鼠進(jìn)行腎上腺次全切除手術(shù)，建立腎上腺功能低下動(dòng)物模型。手術(shù)后大鼠出現(xiàn)了腎上腺功能低下狀態(tài)。然而這種方法對(duì)模型動(dòng)物傷害太大,使該方法難以開展。另外,陽(yáng)虛證需要有腎上腺皮質(zhì)功能抑制表現(xiàn),但機(jī)體中仍然存在著下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的反饋, 切除腎上腺的方法切斷了這一反饋的途徑,與臨床實(shí)際相距太遠(yuǎn)。

甲狀腺切除法即切除動(dòng)物甲狀腺組織造成甲減模型，出現(xiàn)畏寒、肢冷、遲脈等腎陽(yáng)虛主證。伏蕊等〔11〕研究說明甲狀腺摘除術(shù)確實(shí)可以造成大鼠甲減。而甲狀腺完全摘除者，可造成大鼠明顯甲減，更有利于排除甲狀腺激素對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡挠绊憽５摲椒ù笫笏劳雎瘦^高，且完全摘除甲狀腺的成功率較低。

切除動(dòng)物性腺即去勢(shì)法包括切除雄性動(dòng)物雙側(cè)睪丸或雄性動(dòng)物雙側(cè)卵巢。睪丸模型有提肛肌、包皮腺、前列腺、精液腺重量下降、陰莖勃起時(shí)間延長(zhǎng)、持續(xù)時(shí)間縮短等生殖系統(tǒng)的衰退表現(xiàn)外,還有耐力下降、耗氧減少、體溫下降等。該模型血漿促黃體素、促卵泡激素含量上升,雌二醇與睪酮含量下降,T/E下降。

卵巢切除模型下丘腦、垂體、血中的β內(nèi)啡肽含量和下丘腦亮氨酸腦啡肽含量均下降,子宮重量下降,紅細(xì)胞Ca-Mg-ATP酶、Mg-ATP酶、蛋白激酶C等含量下降,骨組織內(nèi)鈣、錳、銅、鋅、鎂等含量下降。

大多數(shù)文獻(xiàn)并不將(雌雄)去勢(shì)動(dòng)物當(dāng)作陽(yáng)虛模型。事實(shí)上,盡管睪丸全切動(dòng)物體內(nèi)雌雄激素的含量表現(xiàn)出與其他某些陽(yáng)虛模型相類似的變化趨向, 然而單純以去除內(nèi)生殖器官的方法所模擬的腎陽(yáng)虛顯然是片面的。

4 傳統(tǒng)病因造模法

陽(yáng)虛是指機(jī)體陽(yáng)氣虛損，機(jī)能減退或衰弱，代謝緩慢，產(chǎn)熱不足的病理狀態(tài)。形成陽(yáng)虛的主要原因多由于先天稟賦不足，或后天失養(yǎng)、勞倦內(nèi)傷、久病損傷陽(yáng)氣所致。腎主生長(zhǎng)發(fā)育和生殖，房事不節(jié)必耗腎精，日久則傷陰損陽(yáng)，導(dǎo)致腎陽(yáng)虛。運(yùn)用傳統(tǒng)病因病機(jī)學(xué)說中的致病因素(通常為改變動(dòng)物的生理、心理狀況、生活環(huán)境及給予過量中藥等)作為誘發(fā)因素,使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在該因素作用下產(chǎn)生中醫(yī)理論上成立的相關(guān)病證所造成的模型更符合中醫(yī)疾病的因果關(guān)系理論和中醫(yī)研究目標(biāo), 這種模型被稱為病因模型。主要有以下四種。

4.1房事傷身動(dòng)物模型 雄性動(dòng)物在短時(shí)間內(nèi)與同一動(dòng)情期雌性動(dòng)物連續(xù)交配數(shù)次，當(dāng)出現(xiàn)呆滯疲勞狀態(tài)時(shí)，再放入另一只新的動(dòng)情期雌性動(dòng)物，又可立即興奮起來，而進(jìn)行交配，稱Coolidge效應(yīng)。同時(shí)采用游泳以造成勞倦過度。如此多次造成腎陽(yáng)虛模型。張丹等〔12〕利用Coolidge效應(yīng)建立腎陽(yáng)虛模型，利用傳統(tǒng)治療腎陽(yáng)虛證的代表藥物——金匱腎氣丸治療后，腎陽(yáng)虛癥狀均明顯好轉(zhuǎn)，為本模型的建立提供了中藥的反證依據(jù)。

4.2老年腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型 臨床研究結(jié)果顯示，老年人與腎陽(yáng)虛病人在內(nèi)分泌軸(主要是甲狀腺與性腺軸)及免疫功能上具有相似的反饋調(diào)節(jié)能力異常,只是腎陽(yáng)虛病人功能紊亂的程度較老年人更為明顯。老年人雖不一定具有腎(陽(yáng))虛外象，卻具有腎(陽(yáng))虛證的內(nèi)涵, 因此，可稱之為生理性腎虛。據(jù)此，人們亦選擇老齡動(dòng)物作為腎(陽(yáng))虛證模型來使用，但臨床關(guān)于衰老本質(zhì)的研究結(jié)果并未能完全支持這種模型的腎陽(yáng)虛辨證: 衰老并非疾病, 參與老化的因素很多，個(gè)體差異也很大, 僅憑年齡或外表來判定衰老程度還不夠全面。因此，用老齡動(dòng)物作腎陽(yáng)虛證模型還需要進(jìn)一步完善。

4.3恐傷腎致腎(陽(yáng))虛動(dòng)物模型 “在臟為腎……在志為恐”，“恐傷腎”，“恐則氣亂”，根據(jù)這一中醫(yī)理論利用造成腎虛證模型。主要有貓嚇鼠、人嚇貓及爆竹嚇狗等方法，造成的病理?yè)p害以生殖腺損傷最為顯著。類似的還有皮膚燒傷法、懸吊應(yīng)激法等。孫理軍等〔13〕將成年(10 w)雄性SD大鼠放入特制的小鐵絲籠內(nèi)，再將此小籠固定在裝有2只家貓的大籠中，讓家貓與大鼠僅一網(wǎng)之隔，使貓爪能碰到但無法抓到大鼠，并且每天上午10∶00、下午3∶00各另取兩只活的實(shí)驗(yàn)淘汰大鼠喂貓，以其凄慘場(chǎng)景示眾，造成模型大鼠的恐嚇，使其驚恐傷腎。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，所造腎虛質(zhì)模型雄鼠出現(xiàn)萎靡不振，體重下降，拱背倦怠，踡縮扎堆，活動(dòng)減少，眼中無神，大便偏濕或便溏，小便色赤量多或清長(zhǎng)等特征。

4.4先天腎虛動(dòng)物模型 根據(jù)初生兒體弱瘦小屬胎稟怯弱、腎精不足之胎怯的中醫(yī)理論,篩選初生3 d內(nèi)、體重顯著不足的動(dòng)物，或利用中醫(yī)恐傷腎理論用恐嚇孕鼠造成子鼠先天腎虛。胎怯者機(jī)體宮內(nèi)發(fā)育未成熟,先天稟賦不足,表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,生理功能低下,其證候?yàn)槠⒛I兩虛尤以腎虛為突出。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)胎怯模型存在垂體-甲狀腺、腎上腺等內(nèi)分泌失調(diào),而恐嚇孕鼠造成的子鼠先天腎虛存在行為學(xué)方面的異常,用金匱腎氣丸溫補(bǔ)腎陽(yáng)藥能預(yù)防和改變之。但尚未對(duì)其腎陽(yáng)虛辨證進(jìn)行研究論證〔14,15〕。

5 其他方法

腎陽(yáng)虛的造模方法還有很多,例如人工高血糖法〔16〕,鎖陽(yáng)水灌注法〔17〕，慶大霉素法〔18〕,環(huán)磷酰胺法〔19〕等等, 這些方法的使用率不高,重復(fù)報(bào)道者少,也不被肯定,故不加詳述。

6 結(jié) 論

腎陽(yáng)虛造模方式主要分病理造模和病因造模，且以病理造模多見。這是因?yàn)榇罅縼碜耘R床的關(guān)于腎陽(yáng)虛證本質(zhì)的病理研究成果作為直接依據(jù)使腎陽(yáng)虛證病理在動(dòng)物體上的再現(xiàn)比單純傳統(tǒng)病因造模更直觀、更理性。但各種病理模型的造模方法在給藥途徑、用藥劑量、造模時(shí)間上差異較大，缺乏規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化給藥理藥效學(xué)研究帶來不便，其結(jié)果的可靠性也因此受到質(zhì)疑。例如,用糖皮質(zhì)激素造模,劑量大動(dòng)物過于衰弱甚至死亡,劑量小動(dòng)物不出現(xiàn)癥狀；又如肌注給藥,動(dòng)物因肌注而致腿瘸,在很大程度上影響動(dòng)物的狀態(tài),以致影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；而腺嘌呤法,由于藥物混在飼料里，很難確保藥物的劑量,而致造模程度不一致，用此模型來觀察藥物療效，不一定能確切反映其結(jié)果。

目前，主張傳統(tǒng)病因造模者越來越多，其符合中醫(yī)理論,也適用于中醫(yī)藥基礎(chǔ)和臨床的研究,盡管其方法不多,但有很好的發(fā)展前景。但是同一中醫(yī)的病因可以導(dǎo)致不同的病證，同一病證又可以有不同的病因，所以利用單純中醫(yī)病因作依據(jù)造成動(dòng)物的病理改變并不能說明它屬于某一個(gè)證，我們?nèi)砸獙?duì)其進(jìn)行辨證,但辨證的依據(jù)還是一個(gè)懸而未決的問題。

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