熟地及有效成分對老年學(xué)習(xí)記憶減退的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子變化的影響

張麗娜 金國琴

(上海中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室，上海 201203)

學(xué)習(xí)記憶功能逐漸減退是衰老的顯著特征之一。熟地及其復(fù)方常被作為防止記憶退化的益智藥物使用，但熟地發(fā)揮益智作用的具體成分并不清楚。本文從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子方面綜述中藥熟地對老年學(xué)習(xí)記憶減退的影響及熟地有效成分對其可能影響。

1 老年學(xué)習(xí)記憶減退的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機制

老年大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸功能呈現(xiàn)過度亢進，容易引起海馬神經(jīng)元長時程增強(LTP)的抑制，并引起糖皮質(zhì)激素高皮質(zhì)酮(GC)血癥〔1〕。大腦邊緣系統(tǒng)——海馬區(qū)域是糖皮質(zhì)激素受體(GCR)密度最高的腦區(qū)，容易受到高濃度皮質(zhì)酮的毒性影響；而海馬又與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，故認(rèn)為海馬GC毒性可能是老年大鼠學(xué)習(xí)記憶退化的重要原因之一〔2〕。

當(dāng)GC與其受體GCR結(jié)合，誘發(fā)胞質(zhì)內(nèi)GCR移向胞核，與目的基因特異性反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。GC-GCR復(fù)合物可以改變神經(jīng)細(xì)胞腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達。BDNF是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，被認(rèn)為是記憶形成過程中的關(guān)鍵蛋白〔3〕。BDNF作用于膽堿能投射纖維終末的自身受體——酪氨酸蛋白激酶受體B (TrkB)，形成配體-受體復(fù)合物。BDNF-TrkB可以增強N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)的磷酸化，調(diào)節(jié)海馬的突觸傳遞〔4〕。大量研究表明磷酸化的NMDAR可以通過其自身的級聯(lián)式的信號傳導(dǎo)途徑，影響海馬神經(jīng)元突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶功能〔5，6〕。NMDAR在海馬和皮層密度最高。它主要是由NR1和NR2亞基構(gòu)成的異多聚體，其中NR1是功能性亞基，NR2是調(diào)節(jié)亞基。NMDAR活化后，可導(dǎo)致鈣離子(Ca2+)內(nèi)流，當(dāng)Ca2+升高到一定濃度時，經(jīng)過Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(Ca2+/CaMKS)信號系統(tǒng)，調(diào)節(jié)海馬LTP形成，這是維持學(xué)習(xí)記憶功能的重要通路之一。另一方面，Ca2+/ CaMKS還可以通過影響cAMP水平，促進絲裂酶原蛋白激酶(MAPK)發(fā)生核轉(zhuǎn)移。MAPK是一族在胞質(zhì)內(nèi)廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶兼底物分子，均能催化下游效應(yīng)蛋白分子的絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾。MAPK家族成員主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38等，分別組成了幾條基本的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑即Ras/ERKI/2通路，JNK/SAPK通路和p38通路在神經(jīng)細(xì)胞生存和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用〔7〕。其中ERK通路激活提高I-κB激酶復(fù)合體(IKK)磷酸化水平，而促進I-κB 磷酸化，最終激活核因子(NF)-κB〔8〕。I-κB是NF-κB的抑制蛋白，分子量為36 kD，由多個亞基組成，其中I-κBα是主要調(diào)控蛋白。正常情況下，I-κB α通過錨蛋白重復(fù)序列將NF-κB核定位序列掩蔽〔9〕。當(dāng)細(xì)胞受刺激后，如慢性應(yīng)激，激活I(lǐng)-κB激酶(IKK)，使I-κB α N-末端32位和36位的絲氨酸磷酸化，再通過多個位點被泛素化，26 S蛋白酶小體降解，從而暴露出NF-κB核定位信號，激活NF-κB，使NF-κB快速易位進入核內(nèi)，與靶基因κB位點結(jié)合，促進相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與免疫、細(xì)胞增殖和凋亡等〔10，11〕。

進入核內(nèi)的ERK還參與調(diào)節(jié)突觸蛋白(Synapsin)的合成。SynapsinⅠ是一種主要位于突觸前末梢的膜蛋白,其基因功能的缺陷能夠造成突觸囊泡數(shù)目的減少和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的明顯改變〔12，13〕。在靜息條件下，SynapsinⅠ處于去磷酸化狀態(tài)，與突觸囊泡膜的胞質(zhì)面、細(xì)胞骨架成分肌動蛋白交聯(lián)〔14〕。當(dāng)神經(jīng)元活動并發(fā)生與synapsin Ⅰ有關(guān)的磷酸化時，囊泡、synapsinⅠ、肌動蛋白三聯(lián)體解離，囊泡在胞質(zhì)內(nèi)移動并與突觸前膜接觸后釋放神經(jīng)遞質(zhì)〔15〕。因此，SynapsinⅠ實際上對神經(jīng)遞質(zhì)的釋放起調(diào)控器作用〔16〕。研究發(fā)現(xiàn)海馬部位SynapsinⅠ激活時間早于皮層,這可能是海馬部位神經(jīng)元更敏感。且在不同的刺激下，SynapsinⅠ的磷酸化位點不同,其中MAPK使突觸蛋白保守結(jié)構(gòu)區(qū)中的site 1(Ser9)磷酸化〔17〕。

因此由上可知道GC-GCR-BDNF-BDNF-TrkB-NMDAR-Ca2+/CaMKS-cAMP-MAPK(Ras/ERKI/2)-IKK-I-κBα-NF-κB-Synapsin Ⅰ信號傳導(dǎo)途徑是老年學(xué)習(xí)記憶退化的重要分子機制之一。

2 熟地防治老年學(xué)習(xí)記憶減退

老年性學(xué)習(xí)記憶減退屬中醫(yī)的“呆癥”和“健忘”范疇,其病位在腦而本于“腎”?！夺t(yī)學(xué)新悟》所述“腎虛則智不足”，強調(diào)了腎虛是學(xué)習(xí)記憶功能減退的主要病機〔18〕。學(xué)習(xí)記憶功能減，補腎滋陰藥能有效改善之。如以熟地為主藥的左歸丸和六味地黃丸等補腎滋陰藥已有研究報道可以改善學(xué)習(xí)記憶功能〔19～31〕。因而熟地黃在改善老年學(xué)習(xí)記憶功能中的作用不容忽視。熟地黃為“壯水之主”，具有益精填髓、滋陰補血的功能。

3 熟地的成分及對學(xué)習(xí)記憶功能的影響

3.1熟地的主要成分 地黃為玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch)的新鮮或干燥塊根,主產(chǎn)于河南。在臨床上有鮮用、干用和熟用的三種。地黃新挖掘或在較短時期內(nèi)采用保鮮措施者稱鮮地黃；經(jīng)晾曬或烘烤除去大部分水分后為生(干) 地黃；經(jīng)特殊炮制加工后稱熟地黃，地黃在常壓下蒸制24 h或加壓下蒸制4 h為最佳炮制時間。熟地黃的成分現(xiàn)代研究證實三種地黃成分存在較大差異。生地黃的主要成分為苷類(其中又以環(huán)烯醚苷為主)、梓醇(含量熟地黃為生地黃的3倍，熟地黃變黑可能與梓醇分解有關(guān))〔22〕、糖類(水蘇糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、蜜三糖等)、氨基酸及黃酮類化合物等〔23〕。熟地黃成分與生地黃相類似。國內(nèi)外藥學(xué)工作者作了大量研究，認(rèn)為熟地黃經(jīng)炮制后主要含有的梓醇、糖類、甙類、5-羥甲基糠醛等成分相對于生地黃發(fā)生了明顯變化。其中5-羥甲基糠醛含量在0.18 %左右，比炮制前增加20 倍左右，是熟地黃質(zhì)量控制選擇的量化指標(biāo)之一〔24，25〕。高效液相色譜法(HPLC)圖譜顯示地黃炮制前后總糖含量無明顯變化，而還原糖則增加5 倍左右。還原糖類包括甘露三糖、蜜二糖及葡萄糖、果糖等〔26〕。川口義夫等〔27〕通過對生、熟地黃研究后認(rèn)為生地黃中蜜三糖、蔗糖等寡糖類在炮制過程中水解， 游離出果糖或變成甘露三糖、蜜二糖及葡萄糖，含量最高的寡糖成分為甘露三糖〔28〕。可見熟地的有效成分最主要的是甘露三糖和5-羥甲基糠醛。其中甘露三糖具有促進造血細(xì)胞的增殖、提高免疫力、降血糖、抗腫瘤等作用〔29〕。

3.2熟地黃與學(xué)習(xí)記憶 崔瑛等〔30〕采用谷氨酸單鈉(MSG)毀損下丘腦弓狀核大鼠模型，通過跳臺實驗和Morris 水迷宮實驗觀察熟地黃對學(xué)習(xí)記憶的影響，結(jié)果顯示熟地黃能延長MSG大鼠跳臺實驗潛伏期、減少錯誤次數(shù)，縮短水迷宮實驗尋臺時間，提高跳臺百分率，提高c-fos、神經(jīng)生長因子(NGF)在海馬的表達。說明熟地黃有改善MSG 大鼠學(xué)習(xí)記憶作用，作用機制可能與提高c-fos，NGF 在海馬的表達有關(guān)〔31〕。

熟地提取液能顯著提高小鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮合成酶(NOS)的活力，增加一氧化氮含量；熟地有提高記憶能力、延緩腦組織衰老的功能〔32〕。熟地的氯仿及乙醇提取液均能明顯提高D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠腦組織中NOS和SOD活性，使NO含量增加，過氧化脂質(zhì)(LPO)含量明顯降低，從而發(fā)揮延緩衰老的作用〔33〕。熟地黃也具有降低小鼠腦線粒體單胺氧化酶(MAO)活性的作用。提示熟地黃及其方劑可以通過調(diào)節(jié)衰老腦組織腦內(nèi)MAO活性而發(fā)揮抗腦老化作用。熟地黃也具有增加小鼠體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)的活性,并能提高D-半乳糖胺致衰老小鼠模型腦組織中SOD的活性而發(fā)揮抗衰老、延年益壽的作用〔34〕。

熟地黃主要成分地黃寡糖預(yù)處理對谷氨酸誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷具有明顯的保護作用。且隨著濃度的升高，保護作用增強〔35〕。

5-羥甲基糠醛(HMF)是熟地黃質(zhì)量控制選擇的量化指標(biāo)之一。口服山茱萸中主要成分5-HMF組小鼠相比于腦缺血再灌注小鼠，Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期和游泳路徑均明顯縮短，跳臺實驗的潛伏期延長，錯誤次數(shù)減少， 腦部SOD 活性升高、MDA 含量降低。說明5-HMF 具有一定的改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用，其機制與抗氧化應(yīng)激損傷作用有關(guān)〔36〕。

熟地有改善學(xué)習(xí)記憶功能減退的作用，但是究竟是哪種成分起到?jīng)Q定性的作用，其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面對學(xué)習(xí)記憶功能的影響機制有待明確。

4 參考文獻

1Smriga M，Saito H，Nishiyama N.Hippocampal long- and short-term potentiation is modulated by adrenalectomy and corticosterone〔J〕. Neuroendocrinology，1996；64:35-41.

2Kullmann DM，Lamsa KP.Long-term synaptic plasticity in hippocampal interneurons〔J〕.Nat Rev Neurosci，2007；8(9):687-99.

3Keiko M，Karl PG.Hippocampus dependent memory formation：do memory type-specific mechanisms exist〔J〕?J Pharmacol Sci，2005；98：191-7.

4Angelucci F，Mathe A，Aloe L.Neurotrophic factors and CNS disorders：finding in rodent models of depression and schizophrenia〔J〕.Pro Brain Res，2004；146(3)：151-65.

5Eckles-Smith K，Claytond D，Bickford P，etal.Caloric restriction prevents age-related deficits in LTP and in NMDA receptorexpression〔J〕. Mol Brain Res，2000；78(1-2)：154-62.

6Zhang H,Lu A，Zhao H，etal.Elevation of NMDAR after transplantation of neural stem cells〔J〕.Neuroreport，2004；15(6)：1739-43.

7Brunet A，Datta SR,Greenberg ME,etal.Transcription-dependent and-independent control of neuronal survival by the PI3K-Akt signaling pathway〔J〕.Curr Opin Neurobiol，2001；11:297-305.

8Lipsky RH，Mazzanti CM，Rudolph JG，etal.Nuclear factor κB is a critical determinant in N-methyl-D-aspartate receptor-mediated neuroprotection〔J〕. J Neurochem，2001;78(2):254-64.

9Iwai K，Lee BR，Hashiguehi M，etal.I-KB-alpha-specific transcript regulation by the C-terminal end of C-Rel〔J〕.FEBS Lett，2005；579(l):141-4.

10Li X，Massa PE，Hanidu A，etal.IKKalPha，IKKbeta，and NEMO/IKK gamma are each required for the NF-κappa B mediated inflammatory response program〔J〕.J Biol Chem，2002；277(47):45129-40.

11Karin M，Yamamoto Y,Wang QM,etal.The IKK NF-κB system：a treasure trove for drug development〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2004；(3):17-26.

12Chen JJ，Yin DZ.A role of synapsin in the process of learning and memory〔J〕.Chem Life，2006；26(4)：334-6.

13Corradi A，Zanardi A，Giacomini C,etal.SynapsinⅠand synapsinⅡ null mice display an increased age-dependent cognitive impairment〔J〕. J Cell Sci，2008；121(18):3042-51.

14Fournier NM，Darnbrough AL,Wintink AJ,etal.Altered synapsin Ⅰ immunoreactivity and fear behavior in male and female rats subjected to long-term amygdale kindling〔J〕.Behav Brain Res,2009；196(1):106-15.

15Hosaka M,Hammer RE,Sudhof TC.A hosphor-swich controls the dynamic association of synapsins with synaptic vesicles〔J〕.Neuron，1999；24(2)：377-87.

16Chi P，Greengard P，Ryan TA.Synapsin dispersion and reclustering during synaptic activity〔J〕.Nat Neurosci，2001；(12):1187-93.

17Menegon A，Bonanomi D，Albertinazzi C,etal.Protein kinase A-mediated synapsinⅠphosphorylation is a central modulator of Ca2+-dependent synaptic activity〔J〕.J Neurosci，2006；26(45):11670-81.

18戴薇薇，金國琴.補腎方藥對衰老大鼠海馬學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因BDNF及其受TrkB mRNA表達的影響〔J〕.中華中華中醫(yī)藥雜志，2008；23(4)：296-9.

19王亞娟，金國琴.補腎方藥延緩老年大鼠學(xué)習(xí)記憶減退的分子機制〔J〕.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009；28(4)：235-8.

20Zhang HP，Zhang YX.P-60 effect of serum from Liu wei Di hua decoction-treated rats on long-term potentiation in hippocampal slices from senescence accelerated mice〔J〕. Acta Pharmacol Sin，2003;2(3)：342-81.

21魏小龍.海馬學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)基因及六味地黃湯益智作用與基因表達關(guān)系的研究〔J〕.生理科學(xué)進展,2000；31(3):227-30.

22王宏潔，邊寶林，楊 健.地黃中梓醇變化條件探討〔J〕.中國中藥雜志，1997；22(7)：408.

23王孝濤，葉定江.歷代中藥炮制法法典現(xiàn)代部分〔M〕.南昌：江西科學(xué)技術(shù)出版社，1989：73.

24劉美麗，白 玫.地黃的炮制研究：熟地黃中5-羥甲基糠醛的提取分離及含量測定〔J〕.中草藥，1995；26(1)：14-6.

25劉 毅.熟地黃藥材質(zhì)量控制芻議〔J〕.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，1990；2(4)：68.

26溫學(xué)森，楊世林，馬小軍，等.地黃在加工炮制過程中HPLC 譜圖的變化〔J〕.中草藥，2004；35(2)：153-6.

27川口義夫.地黃的炮制對所含成分的變化〔J〕.國外醫(yī)學(xué)·中醫(yī)中藥分冊，1984；(5) ：44.

28Kubo M，Asano T，Matsuda H，etal.Studies on Rehmanniae RadixⅢ the relation between changes of constituents and improvable effects on hemorheology with the processing of roots Rehmannia glutinosa〔J〕.Yakugaku Zasshi，1996；116(2)：158-61.

29郭 威，溫學(xué)森，王少云，等.熟地黃中活性成分甘露三糖提取工藝研究〔J〕.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007；21(6)：70-2.

30崔 瑛，侯士良，顏正華，等.熟地黃對毀損下丘腦弓狀核大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬c-fos,NGF表達的影響〔J〕.中國中藥雜志，2003；28(4)：362-5.

31Gai Dingfang，Cojima Satoru，Shen Ziyin，etal.Study of the effect of Bu Yi drugs〔J〕.Jap J Basic Clin，1996；30(10)：2571.

32林 琳.補腎中藥對神經(jīng)系統(tǒng)作用的研究進展〔J〕.湖南中醫(yī)雜志，2004；20(1)：66-8.

33裘 月，杜冠華，屈志煒，等.常用補益中藥抗脂過氧化作用比較〔J〕.中國藥學(xué)雜志，1996；31(2)：83-6.

34曹 凱，劉永平.熟地、菊花、山藥、牛膝四大懷藥對小鼠腦線粒體單胺氧化酶活性的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，1998；18(2)：102-5.

35楊 菁，史佳琳，白 劍，等.地黃寡糖對谷氨酸誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷及葡萄糖攝入的影響〔J〕.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2009；23(2) ：99-103.

36趙 玲，張 蘭，李雅莉，等.5 -羥甲基糠醛對腦缺血再灌注模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦部自由基的影響〔J〕.中國藥房雜志，2007；18(13)：974-6.