膀胱癌干細(xì)胞標(biāo)記物的研究進(jìn)展

王海明 石愛平 許 寧

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，吉林 長春 130021)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，可以直接威脅患者的生存。在全球范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率排在惡性腫瘤的第11位，在我國，膀胱癌發(fā)病率低于西方國家，但近些年來的發(fā)病率有增高的趨勢，嚴(yán)重威脅著患者的健康〔1〕。盡管當(dāng)前在膀胱癌的治療上有了很成熟的治療方案，但對于其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍無好的方法，人們一直在尋找治療膀胱癌的新方法。10多年前，Reya 等〔2〕提出的腫瘤干細(xì)胞(CSCs)學(xué)說中提示腫瘤干細(xì)胞是維持腫瘤生長、復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移的根源所在，為探索腫瘤治療的新途徑提供了依據(jù)。隨著對干細(xì)胞研究的深入，干細(xì)胞在臨床應(yīng)用上的作用越來越受到重視。膀胱癌干細(xì)胞(BCSCs)是一類膀胱組織中具有多向分化潛能的特殊細(xì)胞，被認(rèn)為是膀胱癌發(fā)生的啟動細(xì)胞，可以誘發(fā)腫瘤的形成，BCSCs的研究在了解膀胱癌的發(fā)病機(jī)制及診療中發(fā)揮重要作用，可以為新的診療思路提供依據(jù)，而膀胱癌的特異性標(biāo)志物是BCSCs研究的關(guān)鍵之一。不同組織來源的干細(xì)胞表達(dá)不同的標(biāo)志物，但有些表面標(biāo)志物卻在不同的干細(xì)胞中均有表達(dá)。當(dāng)前研究的CSCs分子標(biāo)志物并不是特異性的標(biāo)志物而僅僅是相關(guān)的標(biāo)志物。目前國內(nèi)外BCSCs標(biāo)志物的研究較少，本文著重對用于BCSCs的標(biāo)志物進(jìn)行綜述，以期進(jìn)一步加深對BCSCs的認(rèn)識，為膀胱癌新的診療方案提供幫助。

1 常用的BCSCs標(biāo)志物

1.1細(xì)胞表面分子標(biāo)志物 目前研究中常見的腫瘤分子標(biāo)志物有CD44、CD47、CD20、CD5、CD133等，而CSCs表面標(biāo)志物并不是特異性的標(biāo)志物，而只是一些相關(guān)的標(biāo)志物，如表面標(biāo)志物CD44+/CD24-/low已證實(shí)是乳腺CSCs的標(biāo)志物〔3〕，CD133+已證實(shí)是肺〔4〕和腦〔5〕等實(shí)體CSCs標(biāo)志物，但這些表面標(biāo)志物也可以是BCSCs表面標(biāo)志物。

1.1.1CD44 CD44屬于黏附分子家族的一員，是一種存在于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，近年來的研究發(fā)現(xiàn)CD44有標(biāo)準(zhǔn)體(CD44S)與變異體(CD44V)兩種，與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。CD44分子有廣泛的生物學(xué)功能，如細(xì)胞表面分子，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及細(xì)胞遷移；參與細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子等相應(yīng)受體的表達(dá)以及重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Wood ward等〔6〕已證實(shí)CD44是造血系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的CSCs相對特異性標(biāo)志物。CD44是公認(rèn)的細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD44+細(xì)胞位于正常尿道上皮及尿路上皮癌的基底層，幾乎常規(guī)用于確認(rèn)膀胱癌。Chan 等〔7〕基于CD44+、CK5+及CK20-分離和鑒定原發(fā)性膀胱癌啟動細(xì)胞亞群，進(jìn)一步證實(shí)此亞群細(xì)胞豐富的致瘤能力，可誘導(dǎo)裸鼠成瘤。另外，對300例膀胱癌患者CD44的表達(dá)分析顯示，有約40%CD44+的亞群腫瘤細(xì)胞。CD44+細(xì)胞亞群誘導(dǎo)腫瘤的效力是表型相同異種移植模型的10～200倍，由此確認(rèn)它們的腫瘤起始能力，證實(shí)了CD44+的高表達(dá)，具有高致瘤性，可作為BCSCs的分選標(biāo)志物。Yang 等〔8〕通過磁性細(xì)胞分選和細(xì)胞培養(yǎng)方法證明：CSCs表達(dá)CD44的變異亞型(CD44v6)和上皮膜抗原(EMA-)，在膀胱癌組織中，EMA-CD44v6陽性細(xì)胞數(shù)約占癌癥細(xì)胞的30%；體外細(xì)胞單克隆實(shí)驗(yàn)分析表明，這些細(xì)胞具有較高的自我更新能力與親代腫瘤有相同的克隆能力。由此可以證明CD44v6+和EMA-的干細(xì)胞具有細(xì)胞集落形成、自我更新和增殖能力，所以認(rèn)定CD44v6+和EMA-是BCSCs的表型，可能是BCSCs分選標(biāo)志物。2013年Zhu等〔9〕利用MB49膀胱癌干細(xì)胞株(MCSCS)通過流式細(xì)胞(FACS)分析證明CD44+和CD133+高表達(dá)于MCSCS；利用定量PCR技術(shù)分析比較證實(shí)OCT4、CD44、CD133和NANOG高表達(dá)于MCSCS。因此，CD44可能作為MCSCS表面標(biāo)記物之一。

1.1.2CD133 CD133又名prominin 1，是一種細(xì)胞表面黏附分子，是一種由5個跨膜結(jié)構(gòu)域的N-糖基化的胞外環(huán)組成的跨膜糖蛋白，雖然其功能尚不清楚，但隨著細(xì)胞的分化，CD133隨之下調(diào)，所以常被應(yīng)用于干細(xì)胞的分離鑒定。Pellacani 等〔10〕證實(shí)CD133可作為前列腺癌的干細(xì)胞標(biāo)志物。Zhu等〔9〕利用MB49 MCSCS通過流式細(xì)胞(FACS)及定量PCR技術(shù)分析證明CD133+高表達(dá)于MCSCS。Bentivegna等〔11〕收集了49例膀胱癌電切組織樣本，經(jīng)染色后通過免疫熒光分析及細(xì)胞遺傳學(xué)分析，分離出CD133高陽性表達(dá)的細(xì)胞，通過免疫組化及裸小鼠移植實(shí)驗(yàn)成功鑒定了此細(xì)胞為BCSCs。所以CD133也可以作為BCSCs的分選標(biāo)志之一。

1.1.3CD47 CD47也稱為整合素相關(guān)蛋白(IAP)，存在于細(xì)胞表面，屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，可對巨噬細(xì)胞的吞噬功能有抑制作用，CD47的表達(dá)與腫瘤免疫及預(yù)后相關(guān)，隨著對其研究的深入，CD47將在腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用，有廣闊的前景。Chan 等〔12〕利用CD47+/CD5+/CD20-分選出BCSCs，發(fā)現(xiàn)CD47在膀胱癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，CD47在BCSCs的特異性增加并也顯著表達(dá)，CD47可與巨噬細(xì)胞表面受體SIRPα結(jié)合，阻斷巨噬細(xì)胞的吞噬，證明了CD47可能是膀胱癌治療的靶點(diǎn)。因此，CD47可能作為一類BCSCs的分選標(biāo)志物。

1.2乙醛脫氫酶1 乙醛脫氫酶(ALDH)是一系列氧化各式各樣醛類轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)酸的酶。近年來的研究表明〔13〕人體細(xì)胞內(nèi)的ALDH1可能在干細(xì)胞生物學(xué)方面發(fā)揮重要作用，已被用作一個標(biāo)記，用來識別和分離干細(xì)胞或者癌干細(xì)胞。ALDH1A1是ALDH1家族的主要成員，Ginestier等〔14〕研究表明，ALDH1A1是乳腺CSCs的標(biāo)記物，其表達(dá)與腫瘤的分期、分級和預(yù)后不良相關(guān)。Su等〔15〕利用ALDEFLUOR及流式細(xì)胞分選(FACS)從人膀胱癌細(xì)胞系中分離出ALDH1 A1+細(xì)胞，通過體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，ALDH1 A1+膀胱癌細(xì)胞與ALDH1 A1-癌細(xì)胞相比具有更高的致瘤性，ALDH1A1表達(dá)降低后，致瘤性也隨之降低，ALDH1A1+膀胱癌細(xì)胞可在體內(nèi)連續(xù)傳代、移植，導(dǎo)致了異質(zhì)細(xì)胞群，該ALDH1A1+膀胱癌細(xì)胞可以代表膀胱癌中的CSCs。另外，Su課題組還利用免疫組織化學(xué)(IHC)的方法對臨床標(biāo)本的分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良的患者與ALDH1A1的高表達(dá)有顯著的關(guān)聯(lián)，因此，ALDH1A1可能是膀胱CSCs相關(guān)的功能標(biāo)志物，并可能是膀胱癌的惡性進(jìn)展和預(yù)后不良的因素。近期，國內(nèi)張海濤等〔16〕應(yīng)用免疫組化的方法對非浸潤性膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織的ALDH1的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在非浸潤性膀胱癌組織中，ALDH1的表達(dá)高于正常膀胱組織，證實(shí)了其與非浸潤性膀胱癌的病理分級、分期及腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)聯(lián)。此外，新出現(xiàn)的證據(jù)表明，ALDH1不僅是一個標(biāo)志物用于干細(xì)胞的標(biāo)記，其也可以起到自我保護(hù)、分化和擴(kuò)展功能的重要作用。

1.3細(xì)胞角蛋白 細(xì)胞角蛋白(CK)是一類主要骨架蛋白，存在于上皮細(xì)胞中的角質(zhì)細(xì)胞中，當(dāng)前已有20多種CK已得到了證實(shí)。CK的表達(dá)某種程度上反應(yīng)了細(xì)胞分化，可作為一種常用的腫瘤免疫組織化學(xué)標(biāo)記物。Chan 等〔7〕證實(shí)了CD44+細(xì)胞中不表達(dá)CK20，可以應(yīng)用CD44+/CK5+/CK20-分離BCSCs。He等〔17〕證實(shí)可應(yīng)用CK17+/CK18-/CK20-/CEAM6-來分離鑒定BCSCs。另外，Ck17是存在于尿路上皮基底細(xì)胞，有很強(qiáng)的成瘤能力，其在SW780細(xì)胞株具有較強(qiáng)的表達(dá)形成的腫瘤細(xì)胞，CK17+常聯(lián)合67 kD層黏連蛋白受體(67LR)陽性的腫瘤細(xì)胞，而排斥的CD66C，通過檢測67LR細(xì)胞基因表達(dá)，顯示在Wnt信號傳導(dǎo)相關(guān)基因高表達(dá)于67LR明亮的細(xì)胞，證明了67LR+/CEACAM6-/CK17+可以應(yīng)用于分離鑒定BCSCs。目前的研究表明CK20、CK17、CK18、CK5和67LR等被認(rèn)為可能是BCSCs相關(guān)的標(biāo)志物。

1.4OCT-4 Oct-4也稱為POU5F1基因，是一個關(guān)鍵的胚胎干細(xì)胞調(diào)控因子，能夠自我更新和分化。OCT-4主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，OCT-4已被引入作為分子標(biāo)記用于生殖細(xì)胞腫瘤。Atlasi 等〔18〕用免疫組化、半定量RT-PCR方法和Western印跡等方法確定了OCT-4幾乎在全部檢測的膀胱癌組織標(biāo)本中表達(dá)，但是，低表達(dá)于癌旁組織及正常膀胱組織標(biāo)本。Zhu等〔9〕利用定量PCR技術(shù)及Western印跡證明OCT-4在自我更新中發(fā)揮了顯著作用，被確定為關(guān)鍵分子，在蛋白質(zhì)水平和mRNA轉(zhuǎn)錄物水平維持自我更新和分化，OCT-4的大量表達(dá)表明OCT-4基因有可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，并與某些癌癥的耐療法或癌癥復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Bentivegna 等〔11〕從49例電切樣本組織分選出OCT-4高表達(dá)的干性細(xì)胞，并證明了膀胱癌患者組織中存在CSCs樣群體。所以，全能干細(xì)胞標(biāo)志物OCT-4可作為BCSCs的標(biāo)志物，它們的表達(dá)也與腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)或抗性的治療方法密切相關(guān)。

1.5Nanog、Bmi-1 Nanog屬于ANTP類NK家族基因，是一種具有自我更新的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因；BMI-1又稱為干細(xì)胞更新因子，是一種自我更新的原癌基因。研究證實(shí)〔19〕Nanog和Bmi-1基因已被證明在某些類型的CSCs中發(fā)揮作用，表明這些調(diào)節(jié)基因的功能是CSCs自我更新和腫瘤發(fā)生的至關(guān)重要因素。王衛(wèi)生等〔20〕通過檢測人膀胱癌組織中Nanog調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，證明干細(xì)胞標(biāo)記基因Nanog在膀胱癌組織中少許表達(dá)，這些細(xì)胞可能是BCSCs，為BCSCs的分離鑒定提供了依據(jù)。Zhu等〔9〕證明Nanog是膀胱癌分化的關(guān)鍵分子，在蛋白質(zhì)水平和mRNA轉(zhuǎn)錄物水平維持自我更新和分化，Nanog的大量表達(dá)表明其與腫瘤耐療法及癌癥的復(fù)發(fā)相關(guān)。Zhang等〔21〕選擇表達(dá)Nanog和Bmi-1等干細(xì)胞基因的患者的膀胱癌組織，利用免疫組織化方法檢測表明，Nanog和Bmi1的在膀胱癌中的高表達(dá)與病理高分級相關(guān)。高表達(dá)Nanog和Bmi-1的細(xì)胞可能代表了一類干細(xì)胞樣的細(xì)胞群，可能作為腫瘤中的潛在的生物標(biāo)志物，與預(yù)后相關(guān)聯(lián)。

1.6ABCG2 ABCG2屬于ABC超家族，是側(cè)群(SP)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，可用于SP細(xì)胞的分離鑒定，作為一個標(biāo)記用于干細(xì)胞的研究。ABCG2是決定SP細(xì)胞分子表型的重要蛋白。Zhu等〔9〕利用MB49 MCSCS通過Western Blot證明ABCG2在MCSCS中大量表達(dá)。Hepburn等〔22〕對148例非浸潤性膀胱癌樣品中進(jìn)行ABCG2表達(dá)的研究，結(jié)果表明ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要在SP側(cè)群中表達(dá)和上調(diào)，SP細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)為非SP細(xì)胞的3倍，ABCG2高表達(dá)的側(cè)群可以作為干細(xì)胞的標(biāo)記，在腫瘤集落形成效率上是ABCG2低表達(dá)的3倍；在體內(nèi)，ABCG2 高表達(dá)的SP細(xì)胞腫瘤富集生長與CSCs是一致的。ABCG2可以作為一類干細(xì)胞標(biāo)記，其高表達(dá)的SP細(xì)胞在人類非浸潤性膀胱癌和MAPK / ERK信號通路中是一個可能的治療靶點(diǎn)。

1.7MAGE-A3 1991年van der Bruggen等〔23〕首次分離出黑色素瘤抗原(MAGE)，根據(jù)在染色體分布的不同部位，將其分為A、B、C、D、E、F六個亞科，黑色素瘤抗原-A3(MAGE-A3)作為MAGE家族中的一員，多在黑色素瘤表達(dá)，在不同類型的腫瘤組織中也廣泛表達(dá)，但罕見表達(dá)于正常的組織(除睪丸和胎盤細(xì)胞)。該抗原不但可被相應(yīng)的MHC Ⅰ類分子呈遞，并且能夠被HLA Ⅱ類分子遞呈給CD4+T或CD8+T細(xì)胞，可使機(jī)體產(chǎn)生針對表達(dá)MAGE-A3腫瘤的細(xì)胞免疫。目前研究報道〔24，25〕在肺癌、食道癌、原發(fā)性肝癌、頭頸部鱗癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌等惡性腫瘤中都陽性表達(dá)MAGE-A3。殷波等〔26〕利用RT-PCR技術(shù)、免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)及Western印跡技術(shù)測定MAGE-A3在BCSCs中的表達(dá)情況，檢測了BCSCs的標(biāo)志物CDl33在T24側(cè)群細(xì)胞中的表達(dá)情況，及其與MAGE-A3的共表達(dá)情況，MAGE-A3和CDl33在T24側(cè)群細(xì)胞中具有陽性共表達(dá)，并證實(shí)了這些側(cè)群細(xì)胞為BCSCs。所以，MAGE-A3有望成為BCSCs一個新的特異性的標(biāo)志物。

2 BCSCs標(biāo)志物在膀胱癌的診療中的應(yīng)用研究

目前針對膀胱癌患者的術(shù)后輔助治療還是傳統(tǒng)的放化療及免疫治療方法，由于治療的盲目性及對藥物的耐受，膀胱癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移并沒有得到根本的解決。最近，從各種人類惡性腫瘤分離出的CSCs的特點(diǎn)表明，CSCs耐受放化療〔27〕，CSCs可能是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源，同時也是干預(yù)治療的理想靶點(diǎn)。Hepburn等〔22〕認(rèn)為ABCG2可以將化療藥物代謝轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外，干擾化療藥物的療效。Chan 等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)CD47可與巨噬細(xì)胞表面受體SIRPα結(jié)合后，阻斷巨噬細(xì)胞的吞噬功能，阻斷CD47能夠在體外增加巨噬細(xì)胞吞噬膀胱癌細(xì)胞的能力，用抗CD47單克隆抗體可阻斷體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，CD47有望成為膀胱癌治療的新靶標(biāo)。BCSCs標(biāo)志物與膀胱癌的發(fā)病機(jī)制診療及預(yù)后密切相關(guān)，利用BCSCs的特異性標(biāo)志物，探索一種選擇性殺滅BCSCs的個體化診療方案并聯(lián)合傳統(tǒng)的治療方案，將是一種膀胱癌治療的新思路新方法。

綜上所述，BCSCs標(biāo)志物在膀胱癌的發(fā)病機(jī)制、抗復(fù)發(fā)療法中發(fā)揮重要作用，盡管一些潛在的干性標(biāo)志物在膀胱癌中已經(jīng)確定，但并非特異性的標(biāo)志物，這些標(biāo)志物還經(jīng)常在正常膀胱干細(xì)胞或祖細(xì)胞中檢測到，因此，需要探索更特異的標(biāo)志物或者聯(lián)合多種標(biāo)志物對BCSCs進(jìn)行標(biāo)記示蹤，已實(shí)現(xiàn)針對CSCs的靶向治療，為癌癥復(fù)發(fā)、耐藥的研究及開辟新的臨床治療領(lǐng)域提供更多理論依據(jù)。

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