腺瘤樣結(jié)腸息肉易感基因蛋白截短與大腸腺瘤及大腸癌早期診斷關(guān)系

楊 春 楊 寶 李 恒 樊海燕 楊銀學(xué)

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科，寧夏 銀川 750001)

大腸癌發(fā)病隱匿，早期沒有明顯癥狀，患者就診時(shí)已經(jīng)處于晚期，失去了治療的最佳時(shí)機(jī)，早期大腸癌手術(shù)患者5年生存率可達(dá)90%以上，晚期手術(shù)伴有轉(zhuǎn)移的患者5年生存率不足10%〔1〕。大腸癌發(fā)生涉及多基因、多步驟的分子病理改變過程，癌基因激活、抑癌基因失活是大腸癌發(fā)生的重要機(jī)制。腺瘤樣結(jié)腸息肉(APC)易感基因是一種抑癌基因，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和自身穩(wěn)定具有重要作用，APC基因發(fā)生突變、截短失去活性是大腸腫瘤發(fā)生的早期分子事件，而且穩(wěn)定存在于腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過程，本研究探討APC基因截短在大腸腺瘤及大腸癌的表達(dá)水平及其在大腸癌早期診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 我院病理科2012年7月至2013年8月34例大腸癌病理標(biāo)本、28例大腸腺瘤標(biāo)本及同期正常大腸組織標(biāo)本15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：大腸癌、大腸腺瘤標(biāo)本均是經(jīng)過病理學(xué)檢查確診的；排除標(biāo)準(zhǔn)：炎癥性腸病患者、家族型腸息肉病史、慢性潰瘍性結(jié)腸炎病史。大腸癌組男18例、女16例，年齡55～67〔平均(53.1±13.5)〕歲；根據(jù)全國大腸癌病理研究分期(Dukes)分期，分為A期8例、B期14例、C期7例、D期5例；其中高分化腺癌9例、中分化腺癌13例、低分化腺癌12例；大腸腺瘤組男15例、女13例，年齡55～69〔平均(55.1±14.2)〕歲；其中管狀腺瘤12例、絨毛腺瘤10例、混合腺瘤6例；正常組男性9例、女性6例，年齡55～70〔平均(52.5±14.7)〕歲。3組年齡、性別差異均不顯著(P>0.05)。

1.2試劑與儀器 MyCycler PCR 儀(美國伯樂公司)，小型臺(tái)式離心機(jī)(Sigma 1-15)，電子分析天平(Satorius)，微量加樣器(Gilson)，Powerpac Universal 電泳儀(Bio-rad)，組織DNA提取試劑盒(美國Omega公司)，TNT?T7 Quick for PCR DNA(美國Omega公司)， SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒 (北京博奧森生物技術(shù)有限公司) 。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 利用蛋白截短檢測(cè)技術(shù)。取所有標(biāo)本，根據(jù)DNA提取試劑盒說明書，提取組織DNA,并溶于無菌雙蒸水，凍存于-20℃冰箱以備用；根據(jù)APC基因的第15外顯子序列設(shè)計(jì)4對(duì)引物，所有上游引物5’端都連接T7啟動(dòng)子序列和翻譯序列，由上海生工生物有限公司合成。15A正義:T7-CAAATCCTAAGAGAGAACAAC，15A反義:CACAATAAGTCTGTATTGTTTCTT。15B正義:T7-GATGATGAAAGTAAGTTTTGCAGTT，15B反義:GAGCCTCATCTGTACTTCTGC。15C正義:T7-TCACCTCATCATTACACGCCTAT，15C反義:TGAAAGTTGACTGGCGTAC。15D正義:T7-AGTGAGTCTGCCTCCAAAGGAC，15D反義:TCACAAGGTAAGACCCAGA。多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度 95℃ 2 min，變性 95℃45 s，退火溫度50℃，45 s，根據(jù)堿基片段長度計(jì)算延伸適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，1 min 延伸1 000 bp，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸 72℃ 5 min〔2〕。TNT 體外翻譯蛋白質(zhì)：所有操作嚴(yán)格按照TNT?T7 PCR Quick Master Mix試劑盒進(jìn)行，體系：模板3 μl(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，TNT?T7 PCR Quick Master Mix 20 μl，甲硫氨酸1 mol/L 0.5 μl，H2O 1 μl，F(xiàn)luoroTectTMGreenLys tRNA 0.5 μl (Promega USA)。同時(shí)做陰性參照組(不加DNA模板)和正常對(duì)照組(正常組織PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，將翻譯的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4判斷標(biāo)準(zhǔn) 電泳后的SDS-聚丙烯酰胺凝膠由膠板取下，去除濃縮膠在ddH2O沖洗干凈后，在熒光或激光激發(fā)分子成像系統(tǒng)下進(jìn)行熒光掃描分析，并留圖存檔。電泳結(jié)果的判定：正常個(gè)體和無截短的突變個(gè)體為一條全長肽鏈，帶終止突變的雜合體為兩條帶，帶終止突變的純活體為一條截短肽鏈，截短肽鏈比全長肽鏈遷移率大，如果出現(xiàn)截短肽鏈，則判定該樣本存在截短型突變(+)。

1.5統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行配對(duì)t和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組APC蛋白截短表達(dá)情況 正常組APC蛋白截短(+)為0%，大腸腺瘤組42.86%，大腸癌組47.06%，大腸腺瘤組和大腸癌組表達(dá)差異不顯著(P>0.05)；正常組與大腸腺瘤、大腸癌組差異顯著(χ2=8.917、P=0.003，χ2=10.481、P=0.001)。

2.2不同大腸瘤組織類型的APC蛋白截短表達(dá)情況 管狀腺瘤組織的APC蛋白截短(+)(75.00%)顯著高于絨毛腺瘤組織(20.00%)和混合腺瘤組織(16.67%)(P<0.05)；絨毛腺瘤組織和混合腺瘤組織差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

及時(shí)處理腺瘤對(duì)降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率具有重要的意義，因此早期腺瘤檢查是降低患者死亡率，提高生存率的關(guān)鍵。APC基因位于染色體5q21，含有15個(gè)外顯子，編碼2 843個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和自身穩(wěn)定的作用〔3〕。APC基因是家族性腺瘤樣息肉易感基因，散發(fā)性結(jié)腸腫瘤中APC基因的表達(dá)也發(fā)生改變。APC基因的15外顯子占其基因編碼區(qū)的75%,是突變密集區(qū)〔4〕。APC基因突變導(dǎo)致其編碼的APC蛋白結(jié)構(gòu)變化，產(chǎn)物多為截短的多肽，截短的APC蛋白可以競爭性與野生型的APC全長蛋白結(jié)合形成二聚體，阻止野生型APC全長蛋白形成同源二聚體，使其不能正常發(fā)揮生理功能，影響細(xì)胞黏附、生長、分化、增殖、凋亡和信號(hào)傳導(dǎo)等正常生物學(xué)特性的改變，發(fā)生細(xì)胞癌變〔5〕。

APC基因是一種抑癌基因〔6〕，在結(jié)直腸癌發(fā)生的起始階段扮演了“看門人”的作用，功能是維持結(jié)腸上皮的完整性〔7〕。APC基因突變或者失活將導(dǎo)致上皮增生并發(fā)展為早期腺瘤，即APC基因突變?cè)谡＜?xì)胞至癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)變中一直存在〔8〕。蛋白截短檢測(cè)技術(shù)是基于PCR、轉(zhuǎn)錄與翻譯相結(jié)合的基礎(chǔ)上，從蛋白質(zhì)水平選擇性檢測(cè)終止型突變的方法，主要應(yīng)用于長片段中發(fā)生截短型突變基因疾病的篩查，單次可以檢測(cè)長達(dá)2～3 kb的基因片段。本研究提示APC基因突變?cè)谡＝M織不存在，只有大腸內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)瘤變時(shí)才會(huì)檢測(cè)到APC基因突變，即APC基因改變?cè)谙倭鲭A段就已經(jīng)發(fā)生，此后一直保存下去，它的失活是大腸腫瘤發(fā)生的早期分子生物改變，且穩(wěn)定保持此狀況于腫瘤發(fā)生的全過程〔9〕，通過蛋白截短技術(shù)對(duì)易感人群進(jìn)行篩查，可以對(duì)于早期大腸瘤變進(jìn)行診斷，有利于大腸癌及大腸瘤患者的早期治療。而且APC蛋白截短的表達(dá)與大腸腺瘤的病理分型有關(guān)，研究結(jié)果顯示APC蛋白截短在管狀腺瘤表達(dá)的陽性率為75%，明顯高于絨毛狀腺瘤和混合腺瘤，對(duì)于臨床大腸腺瘤的病理分型有一定的指導(dǎo)作用〔10〕。APC蛋白截短是否可以作為大腸癌早期診斷的標(biāo)準(zhǔn)，是否可以作為抗腫瘤滯留的靶點(diǎn)，還需要進(jìn)一步研究。

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