廣西H9亞型禽流感病毒的分離鑒定和生物學特性研究

徐　倩，謝芝勛，羅思思，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，黃　莉，黃嬌玲，張艷芳，曾婷婷，王　盛

(1.廣西大學動物科技學院，廣西南寧530001；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室， 廣西南寧 530001)

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廣西H9亞型禽流感病毒的分離鑒定和生物學特性研究

徐倩1，謝芝勛2*，羅思思2，謝麗基2，鄧顯文2，謝志勤2，黃莉2，黃嬌玲2，張艷芳2，曾婷婷2，王盛2

(1.廣西大學動物科技學院，廣西南寧530001；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室， 廣西南寧 530001)

通過對2011年—2014年從廣西不同地區(qū)的活禽市場、養(yǎng)雞場、野生鳥類保護區(qū)等地采集的咽喉腔及泄殖腔拭子進行病毒分離，用血凝及血凝抑制試驗初步鑒定出含H9亞型禽流感病毒的樣品，對其進行純化得到17株H9亞型禽流感病毒，用針對H9亞型禽流感病毒HA基因、N2亞型禽流感病毒NA基因的特異性引物對分離株進行RT-PCR擴增，分別獲得特異性目的片段后進行測序分析，結果顯示所有分離株經(jīng)鑒定均為H9N2亞型禽流感病毒。對所有分離株的生物學特性進行研究，發(fā)現(xiàn)17株H9亞型禽流感病毒分離株均符合低致病禽流感病毒的特點，其中16株分離株通過受體親和特性測定證明具有SAα2,3及SAα2,6兩種受體結合特性，提示具有感染哺乳動物的潛能。

H9亞型禽流感病毒；分離；純化；生物學特性

正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒屬流感病毒，根據(jù)其表面蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(nueraminidase，NA)抗原性的差異，目前已被鑒定出18個HA亞型(H1～H18)和11個NA亞型(N1～N11)[1-3]，其中16種HA亞型(H1～H16)以及9種NA亞型(N1～N9)都可以從禽類分離到[4]。可根據(jù)禽流感病毒(Avian influenza A virus,AIV)對雞的致病力的不同而被分為高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)和低致病性禽流感病毒(lowly pathogenic avian influenza virus，LPAIV)[5]。H9亞型AIV屬于LPAIV，多數(shù)攜帶該病毒的野禽、水禽、家禽并不表現(xiàn)出臨床癥狀或僅表現(xiàn)輕微臨床癥狀，但越來越多的研究表明H9亞型AIV在我國大范圍普遍存在，一旦出現(xiàn)臨床癥狀多表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)癥狀、蛋雞產(chǎn)蛋下降、肉雞生長遲緩等，是影響我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要病原。不僅如此，如果H9亞型AIV與其他病原混合感染則可能引發(fā)更嚴重的疾病,如其與不同亞型的AIV混合感染則可能會在宿主體內(nèi)發(fā)生基因片段重組[6]，從而產(chǎn)生不可預知的新型流感病毒，進而可能引起大流行。特別是20世紀90年代末以來發(fā)生的多起H9N2亞型AIV感染人的事件，以及2013年初引起人感染H7N9亞型AIV經(jīng)基因來源分析發(fā)現(xiàn)，其6個內(nèi)部基因均來自H9N2亞型禽流感病毒[7]。目前，H9N2亞型AIV引起廣泛的關注，其公共衛(wèi)生意義更加凸顯。

本研究對2011年—2014年從廣西不同地區(qū)的活禽市場、養(yǎng)雞場、野生鳥類保護區(qū)等地采集的禽類咽喉及泄殖腔拭子進行禽流感病毒的分離鑒定，并對分離株進行生物學特性研究，分析其潛在致病力及流行情況，旨在為H9亞型禽流感的防控與研究提供參考依據(jù)及基礎材料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品 2011年—2014年從廣西地區(qū)各活禽市場、養(yǎng)雞場、野生鳥類保護區(qū)等采集禽類咽喉及泄殖腔拭子共計2 496份。

1.1.2標準陽性血清與10 mL/L雞血紅細胞 抗H1、H2、H3、H4、H6、H8、H10、H11、H12、H13亞型AIV陽性血清由廣西壯族自治區(qū)動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室制備；抗H5、H7、H9亞型AIV及抗新城疫病毒(NDV)陽性血清,購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所；10 mL/L雞血紅細胞參照文獻[8]制備。

1.1.3SPF雞胚與SPF雞 SPF雞胚購自北京梅里亞公司；SPF雞由所購雞胚無菌孵化而得。

1.1.4主要試劑 RNA 提取Trizol Reagent 試劑,Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑、pMD18-T vector，寶生物(大連)工程有限公司產(chǎn)品；2×TransTaqHiFi PCR SuperMixⅡ，北京全式金公司產(chǎn)品；DNA Gel Extraction Kit，Axygen公司產(chǎn)品；3′-Sialyllactose-PAA-biotin(3′SL-PAA)和6′-Sialyllactose-PAA-biotin(6′SL-PAA)GlycoTech公司產(chǎn)品；鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP)、底物溶液，美國R&D systems公司產(chǎn)品。

1.1.5引物 反轉(zhuǎn)錄引物參照文獻[9]、RT-PCR鑒定擴增引物參照文獻[10]，引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成，并以重蒸水稀釋至25 μmol/L，于-20℃保存待用。

1.2方法

1.2.1病毒分離與初步鑒定

1.2.1.1樣品的處理將采集的咽喉腔及泄殖腔拭子于pH7.2四抗(青霉素10 000單位/mL、鏈霉素10 mg/mL、慶大霉素50 μg/mL、制霉菌素25 μg/mL)PBS緩沖液充分捻轉(zhuǎn)、擠壓，保留液體部分，8 000 r/min離心10 min后收集上清，按照0.2 mL/枚的劑量接種5枚9日齡～11日齡SPF雞胚，收集24 h后自然死亡雞胚的尿囊液。將HA效價高于16個單位的尿囊液保存至-70℃?zhèn)溆?；將HA效價低于16個單位的尿囊液繼續(xù)接種9日齡～11日齡SPF雞胚直至HA效價高于16個單位后保存。

1.2.1.2病毒HA亞型的血清學鑒定 參照《高致病性禽流感診斷技術》國家標準中血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗技術的方法，對所分離病毒進行HA亞型血清學鑒定。將對抗H9陽性血清的HI效價大于或等于5log2的病毒進行純化或傳代。

1.2.2病毒的純化 采用雞胚有限終點稀釋結合特異性血清中和的方法[11-12]純化所分離的H9亞型AIV，每傳一代雞胚即用HI鑒定純化結果，直至連續(xù)2代所分離病毒對抗H9陽性血清的HI效價大于或等于5log2，且對其他亞型AIV陽性血清及新城疫陽性血清的HI效價小于等于3log2。

1.2.3分離株基因亞型的分子生物學鑒定參照Trizol Reagent 試劑使用說明書及文獻[13]中所介紹的方法，對所分離病毒感染SPF雞胚所收集的尿囊液進行RNA抽提，產(chǎn)物用33 μL DEPC處理水重懸；加入1.5 μL 反轉(zhuǎn)錄引物后70℃作用10 min；加入反轉(zhuǎn)錄體系： 5×AMV buffer 10 μL、dNTP(10 mmol/L)4 μL、RNA酶抑制劑 0.5 μL、AMV 1 μL,42℃作用90 min，制成cDNA。用文獻[10]所建立的方法對所有分離株的HA和NA基因進行PCR擴增，并回收目的片段送至Invitrogen公司測序。

1.2.4分離株的命名 按照流感病毒國際命名法則(即：型別/宿主來源/地域來源/毒株序號/分離年代)對純化并鑒定的分離株命名。

1.2.5分離株生物學特性測定

1.2.5.1雞胚半數(shù)致死量(ELD50)和雞胚半數(shù)感染量(EID50)測定 將分離純化所得H9亞型AIV尿囊液用pH7.2四抗PBS緩沖液倍比稀釋為10-5～10-106個梯度，每個梯度稀釋液按照0.2 mL/枚的劑量接種5枚9日齡～11日齡SPF雞胚，置于35℃孵育120 h。記錄每個稀釋度在24 h～120 h致死雞胚數(shù)量，并收集接種后存活24 h以上的所有雞胚尿囊液，分別測定其HA效價。按照Reed-Muench方法計算各分離株的ELD50和EID50。

1.2.5.2SPF雞致病性及排毒期試驗 將分離純化的H9亞型AIV感染SPF雞胚所得新鮮尿囊液用無菌PBS緩沖液稀釋，分別以106EID50/只的劑量滴鼻攻毒5只6周齡SPF雞，并設空白對照5只，觀察14 d。分別于采集攻毒后第1、3、5、7、10、14天采集每只雞的咽喉腔及泄殖腔棉拭子，用SPF雞胚分離的方法檢測排毒，HA效價大于或等于4log2即判為排毒，否則判為不排毒。

1.2.5.3分離株受體親和特性測定 用PBS緩沖液將所分離病毒尿囊液稀釋至7log2～9log2，每個分離株以100 μL/孔包被于96孔板每排12個孔，共2排，4℃包被過夜，以PBS緩沖液作空白對照；每孔加入10 g/L BSA封閉，室溫作用2 h后PBST洗板4次；3′SL-PAA和6′SL-PAA分別設0.5、1、3、5 μg/mL 4個梯度以100 μL/孔加入反應孔，每個梯度重復3次共12個孔，空白對照分別加入1 mmol/L 3′SL-PAA和6′SL-PAA各100 μL，4℃作用2 h，PBST洗板4次；以1∶600劑量加入Streptavidin-HRP100 μL /孔，室溫避光作用2 h，PBST洗板4次；底物溶液顯色15 min～30 min后加1 mol/L H2SO4終止反應。讀取OD 450 nm值。

2　結果

2.1病毒的分離與純化

通過對采集到的咽喉及泄殖腔拭子樣品進行病毒分離、HI試驗，保留了將對抗H9亞型AIV陽性血清HI效價大于或等于5log2的病毒，并通過雞胚有限終點稀釋結合特異性血清中和的方法純化所分離到的病毒，得到了連續(xù)2代對抗H9亞型AIV陽性血清的HI效價大于或等于5log2，且對其他亞型AIV陽性血清及新城疫陽性血清的HI效價小于等于3log2的H9亞型AIV毒株共17株(所有分離株傳代次數(shù)不超過6代)。

2.2分離株基因亞型的分子生物學鑒定

對17個分離株cDNA進行PCR擴增后的凝膠電泳結果見圖1，均與文獻[10]所描述對H9N2亞型AIV擴增結果相一致。將擴增產(chǎn)物進行回收、克隆及測序后，測序結果與GenBank中AIV核酸序列進行Blast比對，所得HA基因序列片段與H9亞型AIV的HA基因序列同源性最高；所得NA基因序列片段與N2亞型AIV的NA基因序列同源性最高。以上兩個結果均可鑒定17個分離株為H9N2亞型AIV，對這17株病毒進行標準命名(表1)。

M.DNA 標準DL 2 000;1～17.17株H9亞型AIV RT-PCR擴增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1-17.The products of RT-PCR of 17 strains of H9 subtype AIVs

圖1　H9亞型禽流感病毒分離株的RT-PCR鑒定

2.3分離株生物學特性的測定

2.3.1雞胚半數(shù)致死量(ELD50)與雞胚半數(shù)感染量(EID50)測定17個分離株的ELD50和EID50結果見表2。

表2　17個H9亞型AIV廣西分離株的ELD50和EID50

2.3.2SPF雞致病性試驗所有分離株以106EID50滴鼻感染6周齡SPF雞后，所有雞只均未發(fā)病，對試驗組與對照組進行臨床觀察未發(fā)現(xiàn)任何區(qū)別，說明17個H9亞型AIV分離株人工感染SPF雞均呈隱性感染，臨床不發(fā)病。17個分離株在攻毒后第1、3、5、7、10、14天，采集咽喉腔及泄殖腔拭子的雞胚病毒分離情況見表3，所有毒株在攻毒后第1、3、5天均全部出現(xiàn)排毒，第14天均再檢測不到排毒。

2.3.3分離株受體親和特性測定受體親和特性測定固相酶聯(lián)試驗結果見圖2，以PBS緩沖溶液作陰性對照成立，除SR/GX/35B15/13株僅具有SAα2,3親和特性外，其余16株分離株均具有SAα2,3和SAα2,6兩種親和特性，其中對SAα2,3的結合能力較高。

3　討論

H9亞型禽流感病毒雖對感染禽的致病率低，但可引起呼吸系統(tǒng)癥狀、蛋雞產(chǎn)蛋下降、肉雞生長遲緩等，因而在普遍存在復合感染的情況下，對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。AIV可感染很多種野鳥、水禽以及家禽，尤其是自由飛翔的水棲鳥類。水禽和野鳥是基因重組病毒主要的基因供體庫。由水禽提供基因，然后在完成病毒重組后傳給雞等陸生家禽，病毒再從陸生家禽回傳到水禽，即形成雙向傳播。

表3　攻毒后排毒檢測

廣西地區(qū)的養(yǎng)禽業(yè)是許多地方的支柱產(chǎn)業(yè)，禽源種類豐富，活禽市場交易以及野生鳥類遷徙等都給H9亞型禽流感病毒的傳播流行提供了便利，因此，對H9亞型禽流感病毒進行病原監(jiān)測對于了解該病毒流行情況、掌握該地區(qū)流行株的生物特性，對于有效控制H9亞型禽流感的發(fā)生和流行具有十分重大的意義。

本研究對廣西不同地區(qū)、不同時間的不同品種家禽甚至野禽進行了H9亞型AIV的病原學檢測，分離純化出17株H9亞型AIV，全部為H9N2亞型。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，雖然多數(shù)家禽、野禽并未表現(xiàn)出任何的臨床癥狀，但是這些健康禽群的H9亞型AIV的攜帶率相當高，無法排除這些病毒在傳播過程中發(fā)生基因重組和突變而產(chǎn)生新型病毒或者毒力加強的可能，其潛在危險不可小覷。通過對分離株的毒力測定及致病性試驗發(fā)現(xiàn)，部分從發(fā)病禽群分離到的H9亞型AIV在實驗室人工感染SPF雞的情況下，并未出現(xiàn)任何臨床癥狀，這可能是因為家禽實地飼養(yǎng)環(huán)境與實驗室環(huán)境相比較為復雜，存在混合感染導致發(fā)病的可能。

血凝素和細胞上受體類型的差異，是影響病毒宿主范圍的主要因素。在以往的研究中有人認為，流感病毒受體主要有兩種類型，即sialic acid-alpha-2,3-terminal saccharides(SAα2,3受體，禽型受體)和sialic acid-alpha-2,6-terminal saccharides (SAα2,6受體，人型受體)。禽流感病毒偏嗜前者，人流感病毒偏嗜后者[14-15]。但是本研究從受體親和特性試驗的結果來看，17株H9亞型AIV廣西分離株中，除了1株(SR/GX/35B15/13)明顯優(yōu)先結合了SAα2,3受體，其余16株均表現(xiàn)出SAα2,3和SAα2,6兩種受體親和特性，表明這些毒株存在跨越種間屏障而感染人類的威脅，值得我們關注和警惕。

圖2　H9亞型AIV受體親和特性測定結果Fig.2　The determined results of receptor binding of H9 subtype AIVs

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Isolation,Identification and Biological Characteristics of H9 Subtype Avian Influenza Viruses

XU Qian1,XIE Zhi-xun2,LUO Si-si2,XIE Li-ji2,DENG Xian-wen2,XIE Zhi-qin2,HUANG Li2,HUANG Jiao-ling2,ZHANG Yan-fang2,ZENG Ting-ting2,WANG Sheng2,

(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning，Guangxi，530004,China;2.Guangxi VeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofAnimalEpidemicEtiologyandDiagnostic,Nanning,Guangxi,530001,China)

Influenza A viruses were isolated from throat and cloacal swabs collected in live poultry markets,poultry farms and wild birds reserves in Guangxi province from 2011 to 2014.17 strains were identified as H9 subtype influenza viruses (AIV) by HA and HI tests.Purified HA and NA genes of H9 AIVs were amplified by RT-PCR and sequenced.The 17 strains of H9 AIVs were identified into H9N2 subtype and lowly pathogenic strainsaccording to the nucleotide sequences and biological characteristics.16 strains were inclined to combine with both SAα2,3 and SAα2,6 influenza A virus receptors which indicated the threat of infection in mammals.

H9 subtype AIV；isolation；purification；biological characteristics

2016-02-29

廣西自然科學基金項目(2013GXNSFDA019015)；桂漁牧科(201204930，201452001)；桂科專項(14-1)

徐倩(1987-)，女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)生物技術研究。*通訊作者

S852.659.5

A

1007-5038(2016)09-0010-06