貓傳染性鼻-結(jié)膜炎實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展

王一鳴，應(yīng) 瑛，劉秋艷，陳小慶，馬劍鋼，趙艷麗，胡桂學(xué)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118）

貓傳染性鼻-結(jié)膜炎是由杯狀病毒科（Caliciviridae）皰疹病毒屬（Vesivirus）的貓杯狀病毒（Feline calicivirus，F(xiàn)CV）引起的貓及貓科動(dòng)物重要呼吸道傳染病，其主要癥狀表現(xiàn)為結(jié)膜炎、急性口腔潰瘍、上呼吸道炎癥和慢性胃炎等。自1957年Fastier首次分離鑒定FCV以來(lái)，在歐洲、美洲、亞洲均有發(fā)現(xiàn)，目前已呈世界性分布[1-2]。貓被認(rèn)為是該病毒的自然宿主。貓杯狀病毒的顯著生物學(xué)特征是僅有一個(gè)血清型,同時(shí)具有豐富的抗原多樣性，遺傳變異性也很強(qiáng)，這成為貓杯狀病毒及時(shí)診斷和有效防制的一大難題。對(duì)病毒進(jìn)行分離鑒定是確切診斷該病毒的慣用方法，對(duì)病毒抗體的檢測(cè)在日常研究中也較為常見。臨床診斷法雖然簡(jiǎn)單易行，但由于癥狀變化較大,易與其他呼吸道疾病混淆，引起誤診。因此,貓杯狀病毒病主要依靠病原學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行確切診斷。

1 病原學(xué)診斷方法

1.1 病毒的分離鑒定 病毒的分離鑒定作為大多數(shù)病毒的常規(guī)診斷方法和經(jīng)典方法，已被各國(guó)實(shí)驗(yàn)室所采用，同時(shí)也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WHO）推薦的方法[3]。盡管不斷有檢測(cè)貓杯狀病毒的新方法出現(xiàn)，但是病毒的分離鑒定作為檢測(cè)病原的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”仍將一直沿用，許多新方法的建立均需用其驗(yàn)證。將處理后的病料接種處于對(duì)數(shù)期的F81細(xì)胞后，在適宜條件下培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變。FCV在F81細(xì)胞上的病變特征是細(xì)胞圓縮、聚集同魚籽樣病變，最后完全脫落、懸浮。若未出現(xiàn)細(xì)胞病變，在接種后3～5 d進(jìn)行細(xì)胞傳代。連續(xù)傳5～6代后，若病料中有病毒存在，則再次接種細(xì)胞后，可出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)。范泉水等[4]應(yīng)用F81細(xì)胞帶毒傳代的方法，先后從處理的樣品中分離到了2株病毒。Abd-Eldaim等[5]認(rèn)為貓杯狀病毒最主要的診斷方法是依靠接種培養(yǎng)好的細(xì)胞來(lái)分離病毒，并使用CRFK細(xì)胞對(duì)2株貓杯狀病毒進(jìn)行了分離鑒定。Poulet等[6]將采集到的拭子樣本稀釋4倍后接種到CRFK細(xì)胞上，以此來(lái)分離病毒。病毒的分離鑒定法具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、可排除動(dòng)物的隱性感染等優(yōu)點(diǎn)，但其相對(duì)耗時(shí)，一般需要多天甚至2周以上才能報(bào)告結(jié)果[7]。

1.2 電鏡檢測(cè)技術(shù) 由于貓杯狀病毒在形態(tài)上有比較明顯的特征，因而可用電鏡技術(shù)或免疫電鏡技術(shù)進(jìn)行鑒定。劉曄等[8]將獲得的HFC-2006培養(yǎng)物接種長(zhǎng)成單層的F81細(xì)胞，采用負(fù)染電鏡技術(shù)，觀察到典型的杯狀病毒粒子。艾純旭等[9]通過(guò)負(fù)染電鏡觀察純化后的FCV，發(fā)現(xiàn)鏡下較多呈二十面體對(duì)稱、直徑35～39 nm、沒有囊膜的病毒粒子，雜蛋白含量較少。電鏡檢測(cè)技術(shù)快速、準(zhǔn)確，但檢測(cè)結(jié)果對(duì)樣品制備、病料采集部位及時(shí)間有一定的要求，且該方法不能用來(lái)區(qū)分異源毒株。免疫電鏡技術(shù)可用來(lái)分析病毒粒子的成分和含量及所包裝病毒粒子的細(xì)胞成分[10]。

2 血清學(xué)診斷方法

目前，血清學(xué)診斷方法主要有病毒中和試驗(yàn)（NT）、免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等，這些方法已廣泛應(yīng)用于貓傳染性鼻-結(jié)膜炎的診斷、血清學(xué)調(diào)查、免疫學(xué)研究和疫苗免疫原性的評(píng)價(jià)。

2.1 病毒中和試驗(yàn) 病毒或毒素與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，失去對(duì)易感動(dòng)物的致病力，謂之中和試驗(yàn)[11]。通過(guò)固定病毒稀釋血清或固定血清稀釋病毒可以檢測(cè)抗FCV血清中和抗體效價(jià)，與陽(yáng)性血清對(duì)比即可判定是否發(fā)生了感染。Masubuchi等[12]采用微板法將FC-7、FC-28、FC-64三種已知疫苗毒血清與58株FCV自然分離株進(jìn)行中和，證實(shí)了自然毒與疫苗毒的抗原相關(guān)性。范泉水等[4]采用固定病毒稀釋血清法，在微量細(xì)胞培養(yǎng)板中，用維持液將兔抗TFCV9710-4株毒和兔抗FCV疫苗標(biāo)準(zhǔn)毒株（F9株）的滅活血清作8～2048倍的稀釋，分別與等量的含100個(gè)TCID50的TFCV9710-4和疫苗標(biāo)準(zhǔn)毒株混合，Reed-Muench法計(jì)算各血清對(duì)2個(gè)毒株50%中和終點(diǎn)稀釋度，以此對(duì)2個(gè)毒株的抗原性進(jìn)行分析。由于貓群中存在自然感染和接種疫苗，血清陽(yáng)性率普遍偏高。因此，中和抗體的存在并不常用于該病的診斷，多用于評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果[7]。

2.2 免疫熒光試驗(yàn) 將已知抗原或抗體標(biāo)記上熒光色素使之成為熒光標(biāo)記物，再用該熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗體或抗原，即可在熒光顯微鏡下觀察特異性熒光反應(yīng)。Fulvio等[13]認(rèn)為，在貓杯狀病毒的慢性感染及再次感染中，用免疫熒光法進(jìn)行診斷的敏感性要低于病毒分離法。但在鑒定細(xì)胞培養(yǎng)分離到的病毒時(shí)，采用免疫熒光法則較為可靠。此外，他們還采用間接免疫熒光試驗(yàn)對(duì)87份黏膜拭子中（眼結(jié)膜和咽喉部）的貓杯狀病毒分離株進(jìn)行鑒定，在加入異硫氰酸熒光素結(jié)合的兔抗貓IgG抗體后使反應(yīng)可見。蔣虹等[14]通過(guò)摸索貓杯狀病毒的培養(yǎng)條件，制備兔抗貓IgG抗體，建立免疫酶染色法（IEA）和免疫熒光法（IFA）2種檢測(cè)貓病毒抗體的血清學(xué)方法。免疫熒光法具有簡(jiǎn)單快速、敏感性高、檢測(cè)費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)。但是，使用該方法在檢測(cè)過(guò)程中可能會(huì)因假陽(yáng)性產(chǎn)生的非特異性熒光而對(duì)結(jié)果判定產(chǎn)生一定干擾。

2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），是將已知的可溶性抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，用相應(yīng)酶標(biāo)記二抗，通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)抗原或抗體，是經(jīng)典的血清學(xué)檢測(cè)方法[15]。其簡(jiǎn)單步驟為采集疑似患病動(dòng)物血清,首先在酶標(biāo)反應(yīng)板包被已知病毒液,加入待檢血清,再加入HRP等酶標(biāo)記的二抗,顯色后用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品OD值。Javier等[16]采用INGENASA、EVL-Eurovet和公司的商品化ELISA試劑盒對(duì)西班牙中部托利多山地區(qū)內(nèi)的野貓群的常見貓病原FIV、FeLv、FCov、FCV、FHV、FPV等進(jìn)行檢測(cè)，其中采用ELISA方法對(duì)FCV的檢出率達(dá)80%。Yuan等[17]根據(jù)IgM的亞型抗體E5和IgG2b的亞型抗體H4兩種單克隆抗體對(duì)FCV的識(shí)別區(qū)域不同，將其用來(lái)包被微孔板，并制備了2種酶標(biāo)記二抗，以此建立檢測(cè)FCV的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，為FCV單克隆抗體的制備及其基本生物學(xué)特性的確定提供了新的技術(shù)路徑。ELISA法具有較高的敏感性,既可以用來(lái)檢測(cè)抗體,又可以檢測(cè)抗原，適于大量樣品的血清學(xué)檢查,且結(jié)果易于分析。

3 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

3.1 核酸探針技術(shù) 核酸分子雜交技術(shù)是20世紀(jì)晚期在生物學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，可以定性和定量檢測(cè)特異性DNA或RNA。對(duì)于不易分離培養(yǎng)的微生物標(biāo)本，及大量培養(yǎng)增殖后有“危險(xiǎn)性”的病毒標(biāo)本，均可用核酸探針直接檢測(cè)。該方法靈敏度較高，適合較大量的標(biāo)本檢測(cè)[18]。Mohamed等[19]評(píng)估、優(yōu)化并授權(quán)了一種使用特異性雜交探針的實(shí)時(shí)RT-PCR方法用于FCV的檢測(cè)和定量。隨著人們對(duì)基因精細(xì)結(jié)構(gòu)的深入細(xì)致的研究和DNA合成技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)能夠人工合成寡聚核苷酸片段作為探針來(lái)使用[20]。由于DNA探針來(lái)源比較豐富，所以可提高探針濃度來(lái)縮短雜交時(shí)間。

3.2 RT-PCR技術(shù)

3.2.1 巢式PCR 巢式PCR檢測(cè)方法是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種分子生物學(xué)診斷技術(shù)，具有特異、敏感、簡(jiǎn)便、快捷等特點(diǎn)，能在數(shù)小時(shí)內(nèi)檢出痕量病原[21]。近年來(lái)，應(yīng)用巢式PCR技術(shù)診斷貓杯狀病毒感染的報(bào)道很多。Fulvio等[13]用巢式PCR方法對(duì)47份結(jié)膜拭子和40份咽拭子進(jìn)行檢測(cè)，并用巢式PCR與RTPCR方法分別對(duì)10倍稀釋的純化F9株進(jìn)行檢測(cè)，然后與病毒分離法進(jìn)行了比較。結(jié)果用一步法RTPCR檢出了5份陽(yáng)性結(jié)膜拭子和12份陽(yáng)性咽拭子，巢式PCR檢出了18份陽(yáng)性結(jié)膜拭子和23份陽(yáng)性咽拭子結(jié)果。而采用病毒分離法僅從5份結(jié)膜拭子和13份咽拭子中分離到病毒。該作者還證實(shí)，F(xiàn)CV在CRFK細(xì)胞的感染性滴度為10-8，巢式PCR的檢測(cè)限為10-11。由此可見，巢式PCR檢測(cè)FCV的敏感性高于一步法RT-PCR和病毒分離等方法。

3.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將熒光素標(biāo)記的探針與引物一起在熒光PCR儀中反應(yīng),整個(gè)反應(yīng)可以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。Chris等[22]采用SYBR green I建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并用此法對(duì)FCV分離株進(jìn)行了檢測(cè)，通過(guò)對(duì)熔解曲線和熔解溫度的分析，可以區(qū)分不同F(xiàn)CV分離株。其敏感度高，可精確定量較寬線性范圍內(nèi)的病毒模板濃度。Mohamed等[19]報(bào)道了以基因組5′區(qū)前20個(gè)核苷酸作為高度保守的引物和探針，建立了檢測(cè)FCV的Taq Man實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，并用此法和病毒分離法同時(shí)對(duì)122個(gè)樣本進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果證實(shí)，該法的靈敏度與特異性與病毒分離法相當(dāng)，但檢測(cè)過(guò)程用時(shí)更短。姜雪等[23]根據(jù)GenBank中編碼FCV衣殼蛋白ORF2的保守序列，設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)引物及相應(yīng)的Taq Man探針，建立了快速檢測(cè)FCV的熒光定量PCR方法。在對(duì)臨床24份疑似病料（其中陽(yáng)性3份、陰性21份）的檢測(cè)中，該方法檢測(cè)cDNA的線性范圍為2.26×1011～2.26×101拷貝/μL；可檢測(cè)出樣品中的FCV，其他相關(guān)病毒檢測(cè)為陰性，與病毒分離結(jié)果相符。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與常規(guī)PCR相比具有特異性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高等特點(diǎn)，有效解決了PCR污染問(wèn)題，可用于FCV的精確診斷以及檢測(cè)所采樣品中的病毒含量[3]。

4 結(jié)論與展望

貓杯狀病毒作為貓科動(dòng)物的一種重要上呼吸道傳染病病原，具有基因變異性強(qiáng)、自然宿主廣泛以及同其他貓上呼吸道疾病相似的特點(diǎn)，為該病的診斷和預(yù)防帶來(lái)很大困難。盡管上述診斷技術(shù)已成功應(yīng)用于貓杯狀病毒病的診斷，使該病的診斷水平邁上了一個(gè)新的臺(tái)階。但基于每種診斷方法的局限性，有必要建立一種集幾種診斷方法于一體的復(fù)合診斷方法，既能夠快速診斷又能保證其準(zhǔn)確性。國(guó)外學(xué)者多采用敏感細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒，再用熒光抗體染色等血清學(xué)方法鑒定病毒，達(dá)到確診的目的[5-13]。有專家指出，F(xiàn)CV的正確診斷途徑應(yīng)同時(shí)包括對(duì)咽拭子和結(jié)膜拭子的檢測(cè)[13]。綜上，在該病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況并結(jié)合已有的實(shí)驗(yàn)條件采用2種或2種以上的方法進(jìn)行診斷。此外，還應(yīng)考慮每種檢測(cè)方法的敏感性和特異性。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展以及人們對(duì)寵物疾病的重視，未來(lái)將會(huì)涌現(xiàn)出更多針對(duì)貓杯狀病毒感染更快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷新技術(shù)。

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