代謝組學(xué)中核磁共振技術(shù)的數(shù)據(jù)分析方法

孫雨航，許楚楚，徐 闖，李昌盛，吳 凌，夏 成

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶163319）

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新，各種組學(xué)（Omics）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。1999年Nicholson首次給出了代謝組學(xué)（Metabolomics）的完整定義，是研究在內(nèi)、外因素作用下，生物體所含內(nèi)源性小分子代謝物（相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000）在種類和數(shù)量上的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律以及生理、病理變化的一門技術(shù)[1]。代謝組學(xué)主要包括3個(gè)檢測(cè)平臺(tái)，分別為氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振技術(shù)（nuclearmagnetic resonance，NMR）。其中，NMR已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

1 NMR數(shù)據(jù)預(yù)處理

從生物學(xué)角度來說，生物種類繁多，內(nèi)源性代謝物濃度差異很大，濃度高的代謝物不一定比濃度低的代謝物更重要，而某些濃度非常低的代謝物在某些生理過程中恰恰不容忽視[2]，所以為了保證所有的化合物在無偏性NMR檢測(cè)后能夠得到公平的分析，就需要對(duì)圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，主要包括歸一化、中心化和尺度方差規(guī)?；?。

目前常規(guī)使用的數(shù)據(jù)預(yù)處理軟件是Topspin（Bruker GmBH，Karlsruhe，Germany）和MestReNova（Mestrelab Research，Santiago de Compostela，Spain）。在Topspin軟件中，所有原始譜圖自動(dòng)進(jìn)行分段積分，手動(dòng)調(diào)零、校正基線和相位；在MestReNova軟件中，原始譜圖被保存為包含所有代謝物化學(xué)位移的“txt”文本，用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 多變量模式識(shí)別軟件

為了從大量的NMR數(shù)據(jù)中得到有價(jià)值的代謝物，需要運(yùn)用降維思想，借助多變量模式識(shí)別[3]。目前，常用的模式識(shí)別軟件通常是昂貴的商用軟件或者內(nèi)部教學(xué)軟件，主要包括SMICA（Umetrics，Ume?，Sweden）和R語言（www.R-project.org），前者最為常見，操作簡(jiǎn)便且智能化，但是分析模式較少；后者指令復(fù)雜，需要專業(yè)人員操做，但是模式識(shí)別種類較多。最近，研究學(xué)者又提出了一種新的核磁數(shù)據(jù)處理軟件MVAPACK，它可以完成數(shù)據(jù)預(yù)處理、模式識(shí)別和模型驗(yàn)證的整個(gè)過程，并已通過實(shí)踐檢驗(yàn)，相信不久的將來許多研究學(xué)者可以通過應(yīng)用免費(fèi)軟件親自進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 主成分分析（Principal component analysis，PCA）

PCA類似于聚類分析，是一種無師監(jiān)督分析方法。從數(shù)學(xué)角度來說，PCA是一種高緯數(shù)據(jù)降緯的方法，就是將分散在一組變量的信息集中到某幾個(gè)綜合指標(biāo)（主要成分）上[3]，從而利用主要成分提取數(shù)據(jù)集的特征，形成一個(gè)二維或三維的得分圖[4]。從生物學(xué)角度來說，PCA就是在不分組的情況下，從整體上來描述樣品的離散趨勢(shì)[5]。

在PCA得分圖中，通常以前兩個(gè)主成分（PC1、PC2）為參數(shù)構(gòu)建模型，主成分后的數(shù)值代表此成分對(duì)于模型分組的貢獻(xiàn)率，數(shù)值越大表示其對(duì)分組的主導(dǎo)作用越大。通常，所有的樣品都將呈現(xiàn)在一個(gè)95%的置信區(qū)間中，區(qū)間以外的樣品被視為異常值。需要注意的是，對(duì)于異常值的處理，需要進(jìn)行異常值檢測(cè)[6]，建立離群模型[7]，綜合考慮分析結(jié)果及其生物學(xué)意義，再?zèng)Q定是否剔除。因此，當(dāng)樣品組間差異較大，組內(nèi)差異較小時(shí)，PCA可以很好地區(qū)分不同組樣品。但是，當(dāng)組間差異較小，組內(nèi)差異較大（組內(nèi)差異變量甚至大于樣本含量）時(shí)，樣本含量較大的一組將會(huì)主導(dǎo)模型，無法呈現(xiàn)組間差異，需要進(jìn)行有師監(jiān)督的模式識(shí)別來凸顯組間差異。

4 偏最小二乘法判別分析（Partial least squares discrim inant ana lysis，PLS-DA）

PLS-DA是一種有師監(jiān)督分析方法（可以通過多次練習(xí)達(dá)到最佳效果），通過利用已知樣品分組信息對(duì)多變量數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類、識(shí)別和預(yù)測(cè)[8]。從模型構(gòu)建上來說，PLS-DA是對(duì)PCA模型的延伸，在PCA模型不分組的基礎(chǔ)上利用虛擬變量分組，人為地將組別定義為Y變量，從而凸顯組間差異。

此外，PLS-DA模型還是一種線性分析法，其優(yōu)勢(shì)就在于其可以結(jié)合載荷圖篩選出代謝物差異[9]，鑒別生物標(biāo)記物[10]。PLS-DA模型也存在自身局限性，因?yàn)槎嘧兞亢推钕禂?shù)的存在可能使其忽視真正的相關(guān)變量[11]。

5 正交的偏最小二乘法判別分析（Orthogonalpartial least squares discrim inant ana lysis，OPLS-DA）

OPLS-DA的構(gòu)建就是為了對(duì)PLS-DA進(jìn)行修正，通過移除與Y變量（分組）無關(guān)的X變量從而最大化組間差異，也可以將其看做一個(gè)純粹的數(shù)據(jù)預(yù)處理過程，或者是一個(gè)具有正交變量?jī)?yōu)勢(shì)的簡(jiǎn)單PLS-DA模型[11]。

與PLS-DA模型相同，在OPLS-DA模型中，參數(shù)R2表示模型的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測(cè)率，R2和Q2的比值越接近于1表示模型越可靠。

OPLS-DA模型驗(yàn)證包括：內(nèi)部驗(yàn)證，7倍交差驗(yàn)證和1 000次（200次）排列驗(yàn)證；外部驗(yàn)證：應(yīng)用受試者工作特征（ReceiverOperating Characteristic，ROC）曲線確定生物標(biāo)記物的準(zhǔn)確性、敏感性和特異性[12]。

對(duì)于篩選生物標(biāo)記物，則需要結(jié)合載荷圖、S圖、皮爾遜相關(guān)系數(shù)，單因素方差分析和學(xué)生t檢驗(yàn)的P值等，來確定差異代謝物，然后進(jìn)行代謝物通路分析，最終完成生物標(biāo)記物的鑒定。條件允許的情況下，還可以進(jìn)行生物標(biāo)記物的相關(guān)性分析，甚至計(jì)算臨界值[13]。

6 OSC-PLS-DA

OSC被認(rèn)為是一種基于PLS模型的數(shù)據(jù)過濾處理技術(shù)，能夠移除與Y響應(yīng)矩陣不相關(guān)的X矩陣，從而使基于相關(guān)性X矩陣的PLS模型能夠更加專一地分析有意義變量。有報(bào)道指出，OSC-PLS-DA就是在PLS-DA[14]或OPLS-DA[15]基礎(chǔ)上結(jié)合正交信號(hào)修正過濾器所建立的分析模型，并且OSC還可以對(duì)PCA模型[16]或NMR光譜[17]進(jìn)行優(yōu)化。在OSC-PLS-DA模型中，OSC可以等于0，1，2，3···，直到PLS-DA模型最佳為止，通過一次次去掉與模型分組無關(guān)的潛在變量，達(dá)到最大化組間差異的目的。

7 結(jié)論

核磁數(shù)據(jù)預(yù)處理是保證所有數(shù)據(jù)能夠被公平地進(jìn)行多變量模式識(shí)別的基礎(chǔ)；PCA是首要的，是對(duì)所有變量的無偏性呈現(xiàn)，能夠使人們從整體上把握樣品水平；而其他3種方法是平行的，互相之間有比較也有優(yōu)化，都能夠直接應(yīng)用于篩選生物標(biāo)記物。在應(yīng)用時(shí)需要根據(jù)樣品組成選擇合適的模式識(shí)別，使之既不過于復(fù)雜又能獲得理想效果。

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