慢性乙肝患者ALT、HBV DNA、ccc DNA及肝組織免疫組化的相關(guān)性

曹 清 朱清仙

(九江市第三人民醫(yī)院，江西 九江 332000)

乙型肝炎病毒(HBV)是最常見的雙鏈DNA病毒，其中HBV復(fù)制中間體為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(ccc DNA)，為mRNA和前基因組RNA合成提供模板，是HBV復(fù)制的重要標(biāo)志之一〔1〕。HBV感染導(dǎo)致的慢性乙型肝炎(CHB)診斷及療效判斷常用指標(biāo)包括HBV熒光定量PCR、血清免疫標(biāo)志物及肝功能等。目前基礎(chǔ)研究證實(shí)，抑制或清除HBV ccc DNA是治療CHB重要方法之一〔2〕。本研究旨在分析CHB患者丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、HBV DNA、ccc DNA及肝組織免疫組化的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選取2011年1月至2013年1月于我院治療的CHB患者60例，根據(jù)有無(wú)接受正規(guī)抗病毒治療分為未治療組(n=42)和治療組(n=28)。入選標(biāo)準(zhǔn)〔3〕：排除其他類型病毒性肝炎(甲、丙、丁、戊)重疊感染，排除酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫性肝病和藥物性肝炎等其他肝病。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝癌、黃疸較深、明顯腹水、明顯出血傾向、多臟器功能衰竭及其他不適合肝穿活檢者。所有患者簽署知情同意書。未治療組男26例，女22例，年齡21～53〔平均(33.3±5.5)〕歲，HBeAg陰性11例，陽(yáng)性31例；治療組男12例，女16例，年齡24～56〔平均(35.1±7.2)〕歲，HBcAg陰性7例，陽(yáng)性21例。治療組經(jīng)聚乙二醇化干擾素α-2a抗病毒治療48 w。自未治療組中選取28例患者為對(duì)照組，男13例，女15例，年齡24～51〔平均(35.9±8.2)歲〕，HBeAg陰性6例，陽(yáng)性22例，對(duì)照組和治療組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組分別進(jìn)行血清和肝組織ccc DNA檢測(cè)及肝組織免疫組化檢測(cè)。

1.2方法

1.2.1病毒學(xué)檢測(cè) 血清HBV DNA檢測(cè)采用熒光定量PCR技術(shù)，試劑盒由廣州中山達(dá)安基因有限公司提供，陰性參考值為<1×103拷貝/ml。

1.2.2HBV標(biāo)志物檢測(cè) 血清HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe和抗HBc采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，試劑盒由上?？迫A生物工程股份有限公司提供。

1.2.3肝功能檢測(cè) 血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、ALT、總膽紅素(TBiL)、白蛋白(ALB)用全自動(dòng)生化分析儀OLYMPUS AU 400檢測(cè)，試劑由北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司提供。

1.2.4肝臟活體組織穿刺病理檢查〔4〕在彩超引導(dǎo)下進(jìn)行肝穿刺活檢，組織長(zhǎng)度約1.0～1.5 cm，后用10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋，切片(厚度4 μm)。采用蘇木素-伊紅(HE)常規(guī)染色，冰凍切片膠原纖維(MASSON)三色染色及網(wǎng)狀纖維染色，采用CMIAS系列多功能真彩色病理圖像分析系列讀片。同時(shí)進(jìn)行Knodell HAI和纖維化評(píng)分。對(duì)肝組織進(jìn)行免疫組化標(biāo)記，試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2.5肝組織cccDNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性檢測(cè) 使用眼科剪將離心管中的肝組織剪碎，并加入10倍體積的抽提緩沖液并振搖使其完全分散于溶液中。將裂解細(xì)胞的懸液置于50℃水浴中3 h。等體積經(jīng)0.5 mol/L Tris.cl(pH 8.0)平衡的酚加入溶液中并緩慢地來(lái)回顛倒離心管10 min。形成乳濁液后于室溫以5 000 r/min離心15 min，使兩相分開。用大口徑移液管(出口徑為0.3 cm)將黏稠的水相移至一潔凈的離心管中，用酚重復(fù)抽提2次。酚抽提取第三次將全部水相移至另一離心管中，于室溫加0.2體積的10 mmol/L乙酸銨和2倍體積的乙醇，充分混合，即形成DNA。測(cè)定DNA樣品在260 nm和280 nm處的光吸收。將DNA貯存于4℃冰箱。熒光檢測(cè)儀自動(dòng)讀取并記錄CT值，計(jì)算出拷貝數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1未治療組患者血清學(xué)資料 未治療組中HBeAg陽(yáng)性與陰性患者之間ALT水平〔(149.43±56.38)vs(135.45±67.47)U/L〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HBeAg陽(yáng)性患者血清HBV DNA水平〔(6.84±1.24)log10IU/ml〕和肝細(xì)胞HBV ccc DNA水平〔(5.71±1.22)log10IU/ml〕均較HBeAg陰性患者〔(5.12±1.27)、(4.37±1.14)log10IU/ml〕顯著升高(P<0.05)。

2.2未治療組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與肝纖維化分期的相關(guān)性分析 未治療組患者肝細(xì)胞中HBV DNA(r=-0.215，P=0.034)和ccc DNA水平均與肝組織纖維化程度呈負(fù)相關(guān)，其中ccc DNA呈強(qiáng)相關(guān)性(r=-0.523，P=0.004)，與ALT水平則無(wú)相關(guān)性(r=0.024，P=0.796)。肝細(xì)胞HBV DNA和ccc DNA之間未顯示相關(guān)性(r=0.064，P=0.642)。與ALT水平則無(wú)相關(guān)性(r=0.037，P=0.784)。

2.3肝細(xì)胞內(nèi)HBV ccc DNA與血清HBV DNA水平的相關(guān)性分析 對(duì)所有80例患者進(jìn)行分析，結(jié)果提示肝細(xì)胞內(nèi)HBV ccc DNA水平〔(5.7 ± 1.5)log10IU/ml〕與血清HBV DNA〔(6.1 ± 1.3)log10IU/ml〕無(wú)相關(guān)性(r=0.079，P=0.525)。

2.4抗病毒治療患者體內(nèi)HBV標(biāo)志物的表達(dá)水平 治療48 w后肝細(xì)胞HBV DNA、 ccc DNA〔(2.85±1.12)、(3.17±1.12)log10IU/ml〕較對(duì)照組〔(5.45±1.43)、(5.86±1.53)log10IU/ml〕顯著下降(P<0.05)。

3 討 論

HBV感染是全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，全球約20億人曾感染過(guò)HBV，慢性HBV感染者約有3.5億人成為，我國(guó)慢性無(wú)癥狀HBV攜帶者約1.2億〔5〕。新發(fā)的或時(shí)間相對(duì)較短的CHB患者檢測(cè)HBeAg陽(yáng)性，被稱為HBeAg陽(yáng)性的CHB。但隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，部分患者出現(xiàn)了HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清學(xué)轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致了HBeAg陽(yáng)性的CHB患者比率逐漸下降，而HBeAg陰性的CHB患者比率逐漸升高〔6〕。在HBeAg陰性期，HBeAg檢測(cè)陰性、ALT持久正常(PNAL)、血清HBV DNA水平很低或不可測(cè)、肝活檢顯示肝臟炎性壞死程度極微或無(wú)炎性壞死和肝纖維化程度極輕微到輕微，絕大多數(shù)患者處于非活動(dòng)性、病毒低復(fù)制狀態(tài)(非活動(dòng)性HBV攜帶狀態(tài))，但部分HBeAg陰性患者會(huì)發(fā)展為免疫激活狀態(tài)(即HBeAg陰性CHB)，主要表現(xiàn)為ALT升高及高血清HBV DNA水平〔7〕。肝細(xì)胞核內(nèi)有穩(wěn)定的ccc DNA存在，是慢性感染的基礎(chǔ)之一，核苷類抗病毒藥不能清除ccc DNA以致停藥后復(fù)發(fā)。因此只有徹底清除細(xì)胞內(nèi)ccc DNA才能根治HBV感染。診斷肝臟纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)是肝組織的病理切片檢查，但操作存在風(fēng)險(xiǎn)性，因此高特異性及敏感性的血清學(xué)指標(biāo)是肝纖維化診斷學(xué)研究的熱點(diǎn)方向。有報(bào)道稱，CHB患者血清內(nèi)檢測(cè)到高含量HBV ccc DNA，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與肝組織損傷嚴(yán)重程度(肝臟病理評(píng)分的高低)有關(guān)〔8〕。肝細(xì)胞內(nèi)以及血清HBV ccc DNA與肝臟組織纖維化程度之間的關(guān)系，可通過(guò)更大樣本量試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

本研究顯示血清中ccc DNA水平與ALT值密切相關(guān)，從而說(shuō)明患者血清中ccc DNA水平是肝臟損害的標(biāo)志，可作為反映肝功能的又一臨床參數(shù)。另外，肝組織纖維程度與肝細(xì)胞HBV ccc DNA呈負(fù)相關(guān)，HBV DNA水平與肝內(nèi)病毒復(fù)制情況不存在相關(guān)性。

4 參考文獻(xiàn)

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