Nrf2在酒精性肝損傷模型中的研究進(jìn)展

邢會(huì)杰，宋琳亮，方梅霞，和 君，李守軍，傅江南

(1. 暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，廣州 510632; 2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

肝臟是徑口攝入的外源性毒物在小腸吸收后首先被暴露的器官，是機(jī)體執(zhí)行解毒和代謝自穩(wěn)態(tài)功能的主要位點(diǎn)[1]。肝臟也是酒精在體內(nèi)代謝的特異性器官[2]。酒精消費(fèi)與多達(dá)60多種疾病相關(guān)，在美國，每年因慢性肝病死亡的26000人中，其中有46%與酒精濫用或酗酒有關(guān)[3]。酒精在肝臟代謝過程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激是引起酒精性肝損傷的主要因素，酒精刺激肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，為了維持機(jī)體的氧化還原平衡，一系列抗氧化蛋白如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶以及谷胱甘肽還原酶參與反應(yīng)，清除過多的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，它們的共同作用保護(hù)了細(xì)胞和組織免受氧化應(yīng)激損傷。一旦體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species, RNS)等產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷[4]。核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2 (nuclear factor-erythroid-related factor 2, Nrf2) 是在肝臟中調(diào)節(jié)一系列解毒和抗氧化防御基因表達(dá)的必須轉(zhuǎn)錄因子，是體內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其可以通過促進(jìn)多種Ⅱ相抗氧化酶和解毒酶的表達(dá)，發(fā)揮重要的抗氧化作用，是目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞抗氧化應(yīng)答的核心途徑之一，能夠顯著誘導(dǎo)機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答[5-7]。在氧化應(yīng)激情況下，Nrf2可與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element, ARE)結(jié)合介導(dǎo)它的目的基因表達(dá)[8]。本文將對(duì)Nrf2的分子結(jié)構(gòu)，激活和降解，分子調(diào)控機(jī)制以及在酒精介導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激中的作用進(jìn)行綜述。

1 Nrf2概述

1.1 Nrf2分子結(jié)構(gòu)

Nrf2是一種堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，屬于CNC (Cap‘n’collar) )轉(zhuǎn)錄因子家族中活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[9]，Nrf2的分子結(jié)構(gòu)包含Neh1-6區(qū)，這些區(qū)在不同物種間高度保守[10-11]。其中，Nehl區(qū)是bZipDNA結(jié)合區(qū)，Nrf2通過Nehl區(qū)與Mafs發(fā)生相互作用，并與DNA形成異二聚體。Neh2區(qū)介導(dǎo)Nrf2與胞質(zhì)抑制因子Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)的結(jié)合。Neh3區(qū)位于Nrf2羧基末端，對(duì)于Nrf2下游多種抗氧化反應(yīng)元件ARE依賴性基因的轉(zhuǎn)錄激活具有重要作用。Neh4和Neh5區(qū)共同結(jié)合另一種轉(zhuǎn)錄共激活因子CBP，參與Nrf2轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。Neh6區(qū)目前被認(rèn)為是一種Keapl非依賴性的Nrf2負(fù)性調(diào)控區(qū)域，參與Nrf2的降解[12]。

1.2 Nrf2的激活和降解

在正常生理自穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下，Nrf2的激活依賴于Keap1, Nrf2和Keap1在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成復(fù)合體處于抑制狀態(tài)，并通過Keap1介導(dǎo)的泛素化對(duì)Nrf2持續(xù)進(jìn)行降解以維持轉(zhuǎn)錄形成的Nrf2之間的平衡[13]。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激或親電子基團(tuán)刺激時(shí)，Keap1介導(dǎo)的泛素化被阻止，導(dǎo)致Keap 1的構(gòu)像發(fā)生改變，使Nrf2從Keap l上解耦聯(lián)，Nrf2核轉(zhuǎn)位水平升高，游離的Nrf2進(jìn)入核內(nèi)，與下游目標(biāo)基因的ARE結(jié)合并介導(dǎo)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而激活Nrf2信號(hào)通路[14-15]。在氧化還原平衡恢復(fù)之后，Nrf2轉(zhuǎn)回入胞漿并通過泛素化降解，促進(jìn)Nrf2的消耗，使Nrf2維持到正常水平[16-17]。過去幾十年的研究證據(jù)表明CNC轉(zhuǎn)錄因子家族的另外一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Bach1也可以激活Nrf2，生理狀態(tài)下，Bach1結(jié)合到ARE啟動(dòng)子區(qū)域阻止Nrf2的結(jié)合[18]。在應(yīng)激狀態(tài)下，Bach1被Nrf2取代，導(dǎo)致Nrf2激活，這說明在不同細(xì)胞狀態(tài)下，Bach1與Nrf2可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到同一基因結(jié)合位點(diǎn)[19]。

1.3 Nrf2主要目標(biāo)基因

作為對(duì)氧化應(yīng)激或親電子基團(tuán)刺激的反應(yīng)，Nrf2轉(zhuǎn)位入核和Maf形成異二聚體后與ARE結(jié)合通過上調(diào)下游抗氧化目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄控制著細(xì)胞的命運(yùn)，而這些目標(biāo)基因的最主要特點(diǎn)是在其啟動(dòng)子區(qū)域都含有ARE序列。 Nrf2可介導(dǎo)多種細(xì)胞保護(hù)和解毒基因的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮功能，其調(diào)控的下游目標(biāo)基因[20-24]主要包括 谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteineligase, GCL)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)，硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)，硫氧還蛋白還原酶 (thioredoxin reductase, TrxR)，過氧化物氧化還原酶(peroxiredoxin, Prx)和血紅素單加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)等氧化還原平衡蛋白，具有保持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和 硫氧還蛋白水平以及降低ROS水平的功能；谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶 (Glutathione-S-transferase, GST)，NAD(P)H：醌氧化還原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase-1, NQO1)和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)等II相解毒酶，在體內(nèi)主要發(fā)揮降解外源性毒物轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)和催化結(jié)合反應(yīng)提高外源性毒物的水溶性以利于消除的作用；和多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以控制內(nèi)源性底物和外源性毒物的吸收和排出。

2 Nrf2的分子調(diào)控機(jī)制

Keapl即是氧化物和親電子物質(zhì)誘導(dǎo)Nrf2活化的化學(xué)感受器，也是泛素-蛋白酶系統(tǒng)介導(dǎo)Nrf2降解的調(diào)節(jié)器，在Nrf2信號(hào)通路的分子調(diào)控機(jī)制中居于核心地位[22]。生理狀態(tài)下，Keap l作為cullin 3 (Cul3)-Rbxl-E3泛素連接酶與底物Nrf2的連接分子，不斷對(duì)Nrf2進(jìn)行泛素化和蛋白酶體降解，此時(shí)細(xì)胞的Nrf2低水平表達(dá)[25]。當(dāng)機(jī)體在氧化應(yīng)激或親電子物質(zhì)刺激情況下，Nrf2通過與Keapl蛋白上的關(guān)鍵半胱氨酸殘基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使Keapl-Cul3-Rbxl-E3復(fù)合體分離，從而抑制Nrf2泛素化，并增強(qiáng)Nrf2蛋白的穩(wěn)定性，Nrf2呈高水平表達(dá)并轉(zhuǎn)移入核發(fā)揮作用。當(dāng)機(jī)體自穩(wěn)態(tài)恢復(fù)，Keapl從胞漿中穿梭進(jìn)入細(xì)胞核，從ARE上移走Nrf2，然后Nrf2-Keapl復(fù)合物再次移位出核轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)中，Nrf2-Keapl復(fù)合物則再次通過Cul3-Rbxl-E3依賴性泛素酶機(jī)制降解。Nrf2重新保持低水平表達(dá)，Nrf2信號(hào)通路被抑制[22]。研究發(fā)現(xiàn)，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)，磷酸肌醇激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)，蛋白酶C (protein kinase C, PKC)等激酶通路均參與Nrf2的分子調(diào)控，其機(jī)制是蛋白激酶能通過直接磷酸化Nf2的方式促使其與Keap1分離，激活Nrf2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[26]。另外，Bach1通過與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ARE啟動(dòng)子區(qū)域位點(diǎn)達(dá)到對(duì)Nrf2的調(diào)控，這被認(rèn)為是Nrf2通路的一種新的反饋抑制調(diào)節(jié)機(jī)制[19]。

3 Nrf2在酒精性肝損傷模型中的作用

Nrf2是否在酒精介導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激損傷中起主要作用尚不完全清楚，對(duì)Nrf2的研究結(jié)論中尚存在相互矛盾的觀點(diǎn)。多數(shù)認(rèn)為Nrf2的激活在對(duì)抗酒精介導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激中具有重要作用。在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)利用Nrf2基因缺陷小鼠飼喂一定劑量的酒精后與野生型小鼠相比增加了肝臟相關(guān)疾病的致死率，并認(rèn)為酒精對(duì)Nrf2基因缺陷小鼠的不利效應(yīng)是由于脂肪生成的增加，總谷胱甘肽和線粒體谷胱甘肽的耗竭和庫弗氏細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的加劇的綜合結(jié)果[27]。離體實(shí)驗(yàn)利用siRNA技術(shù)，對(duì)Nrf2基因進(jìn)行干擾后發(fā)現(xiàn)，酒精介導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化水平明顯升高[28]，另外，在用酒精孵育人類肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出酶釋放提高，GSH耗竭和脂質(zhì)過氧化水平的上升。也證實(shí)了Nrf2具有保護(hù)肝細(xì)胞避免酒精介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的作用[29]。胎兒酒精綜合癥是酒精濫用的主要毒副效應(yīng)，近來利用待孕母鼠給予酒精飼喂實(shí)驗(yàn)[30]發(fā)現(xiàn)，可明顯提高小鼠胚胎中Nrf2蛋白和Nrf2-ARE結(jié)合，并伴隨著多種Nrf2下游目標(biāo)抗氧化基因和蛋白如SOD1、SOD2、SOD3、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶、硫氧還蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶中等程度的升高[31]。以上諸多結(jié)果表明，Nrf2在避免酒精介導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激損傷中具有重要保護(hù)作用。

然而，也有與以上相反的研究結(jié)果認(rèn)為，機(jī)體在酒精介導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激損傷保護(hù)中，HO-1作為抗氧化防護(hù)因子具有關(guān)鍵性作用，其具體機(jī)制是在酒精介導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激損傷期間HO-1是依賴Nrf2被激活后發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用的。這一觀點(diǎn)在大鼠給予酒精實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Nrf2在肝臟的表達(dá)下降得到證實(shí)，同時(shí)研究認(rèn)為另外一個(gè)AREs的調(diào)控子ATF4可能是上調(diào)氧化應(yīng)激保護(hù)基因的主要機(jī)制[32]。Yeligar等[33]也認(rèn)為酒精介導(dǎo)的HO-1并不主要是由庫弗氏細(xì)胞中的Nrf2調(diào)控的，他們指出HO-1在給予酒精的大鼠模型中主要是由枯否氏細(xì)胞中的低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1α)調(diào)控的，同時(shí)指出HO-1的上調(diào)阻止了酒精介導(dǎo)的肝損傷中炎性因子的過量形成而對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)作用。

4 結(jié)語

目前的研究已經(jīng)明確，Nrf2信號(hào)通路是在生物體抵御外源性刺激和毒物的適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)中具有重要作用。雖然Nrf2在酒精性肝臟氧化應(yīng)激損傷中是否起主要保護(hù)作用尚有爭(zhēng)議，但至少可以確定的是酒精介導(dǎo)的肝損傷氧化應(yīng)激水平與Nrf2基因具有相關(guān)性，關(guān)于酒精性肝病研究中對(duì)Nrf2基因的研究還處于初期階段，接下來還有很多關(guān)于Nrf2在酒精性肝病中未知問題需要進(jìn)一步研究加以證實(shí)。但越來越多的研究表明，Nrf2在涉及氧化應(yīng)激損傷的人類多種疾病中具有重要的細(xì)胞保護(hù)作用，隨著對(duì)Nrf2研究的進(jìn)一步深入，對(duì)Nrf2分子的功能、激活方式、目標(biāo)底物、分子調(diào)控機(jī)制和在疾病中的生物學(xué)作用等方面的了解和認(rèn)識(shí)也會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)，并為其在生物學(xué)等領(lǐng)域的機(jī)理研究、以及預(yù)防和干預(yù)治療與之相關(guān)的疾病開辟新途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] Shin SM, Yang JH, Ki SH. Role of the Nrf2-ARE pathway in liver diseases [J]. Oxid Med Cell Longev,2013:763257.

[2] Wu KC, Liu J, Klaassen CD. Role of Nrf2 in preventing ethanol-induced oxidative stress and lipid accumulation [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2012, 262(3):321-329.

[3] Yoon YH, Yi H. Liver cirrhosis in the United States, 1970-2007 surveillance report #88. 2010. NIAAA homepage. http://pubs.niaaa.nih.gov/publications/surveillance88/Cirr07.htm

[4] Lu SC, Mato JM. Role of methionine adenosyltransferase and S-adenosylmethionine in alcohol-associated liver cancer [J]. Alcohol, 2005, 35(3):227-234.

[5] Copple IM. The Keap1-Nrf2 cell defense pathway - a promising therapeutic target? [J]. Adv Pharmacol, 2012, 63:43-79.

[6] Lewis KN, Mele J, Hayes JD, et al. Nrf2, a guardian of healthspan and gatekeeper of species longevity [J]. Integr Comp Biol, 2010, 50(5):829-843.

[7] Magesh S, Chen Y, Hu L. Small molecule modulators of Keap1-Nrf2-ARE pathway as potential preventive and therapeutic agents [J]. Med Res Rev, 2012, 32(4):687-726.

[8] Mathers J, Fraser JA, McMahon M, et al. Antioxidant and cytoprotective responses to redox stress [J]. Biochem Soc Symp, 2004, (71):157-76.

[9] Yu X, Kensler T. Nrf2 as a target for cancer chemoprevention [J]. Mutat Res, 2005, 591(1-2):93-102.

[10] Kobayashi M, Yamamoto M. Molecular mechanisms activating the Nrf2-Keap1 pathway of antioxidant gene regulation [J]. Antioxid Redox Signal. 2005, 7(3-4):385-94.

[11] Lee JM, Li J, Johnson DA,etal. Nrf2, a multi-organ protector?[J]. FASEB J. 2005,19(9):1061-6.

[12] Baird L, Dinkova-Kostova AT.The cytoprotective role of the Keap1-Nrf2 pathway[J]. Arch Toxicol., 2011,85(4):241-72.

[13] Rushworth SA, Macewan DJ. The role of Nrf2 and cytoprotection in regulating chemotherapy resistance of human leukemia cells [J]. Cancers (Basel), 2011, 3(2):1605-1621.

[14] Huang HC, Nguyen T, Pickett CB. Phosphorylation of nrf2 at ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription [J]. J Biol Chem, 2002, 277(45):42769-42774.

[15] McMahon M, Itoh K, Yamamoto M, et al. Keap1-dependent proteasomal degradation of transcription factor nrf2 contributes to the negative regulation of antioxidant response element-driven gene expression [J]. J Biol Chem, 2003, 278(24):21592-215600.

[16] Giudice A, Arra C, Turco MC. Review of molecular mechanisms involved in the activation of the Nrf2-ARE signaling pathway by chemopreventive agents [J]. Methods Mol Biol. 2010, 647:37-74.

[17] Itoh K, Mimura J, Yamamoto M. Discovery of the negative regulator of Nrf2, Keap1: a historical overview [J]. Antioxid Redox Signal, 2010, 13(11):1665-1678.

[18] Shan Y, Lambrecht RW, Donohue SE, et al. Role of Bach1 and Nrf2 in up-regulation of the heme oxygenase-1 gene by cobalt protoporphyrin [J]. FASEB J, 2006, 20(14):2651-2653.

[19] Kaspar JW, Jaiswal AK. Antioxidant-induced phosphorylation of tyrosine 486 leads to rapid nuclear export of bach1 that allows nrf2 to bind to the antioxidant response element and activate defensive gene expression [J]. J Biol Chem, 2010, 285(1):153-162.

[20] Reisman SA, Csanaky IL, Aleksunes LM, et al. Altered disposition of acetaminophen in nrf2-null and keap1-knockdown mice[J]. Toxicol Sci, 2009, 109(1):31-40.

[21] Long DJ 2nd, Gaikwad A, Multani A, et al. Disruption of the nad(p)h:quinone oxidoreductase 1 (nqo1) gene in mice causes myelogenous hyperplasia [J]. Cancer Res, 2002, 62(11):3030-3036.

[22] Rushworth SA, Chen XL, Mackman N, et al. Lipopolysaccharide-induced heme oxygenase-1 expression in human monocytic cells is mediated via nrf2 and protein kinase C [J]. J Immunol, 2005, 175(7):4408-4415.

[23] Chi L, Ke Y, Luo C, et al. Depletion of reduced glutathione enhances motor neuron degeneration in vitro and in vivo [J]. Neuroscience, 2007, 144(3):991-1003.

[24] Jung KA, Kwak MK. The Nrf2 system as a potential target for the development of indirect antioxidants [J]. Molecules, 2010, 15(10):7266-7291.

[25] Furukawa M, Xiong Y. BTB protein Keap1 targets antioxidant transcription factor Nrf2 for ubiquitination by the Cullin 3-Roc1ligase [J]. Mol Cell Biol, 2005, 25(1):162-171.

[26] Zhang H, Forman HJ. Acrolein induces heme oxygenase-1 through pkc-delta and pi3k in human bronchial epithelial cells [J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2008,38(4):483-490.

[27] Lamlé J, Marhenke S, Borlak J, et al. Nuclear factor-eythroid 2-related factor 2 prevents alcohol-induced fulminant liver injury [J]. Gastroenterology, 2008, 134(4):1159-1168.

[28] Gong P, Cederbaum AI. Nrf2 is increased by CYP2E1 in rodent liver and HepG2 cells and protects against oxidative stress caused by CYP2E1 [J]. Hepatology, 2006, 43(1):144-153.

[29] Yao P, Nussler A, Liu L, et al. Quercetin protects human hepatocytes from ethanol-derived oxidative stress by inducing heme oxygenase-1 via the MAPK/Nrf2 pathways [J]. J Hepatol, 2007, 47(2):253-261.

[30] Abu-Bakar A, Satarug S, Marks CG, et al. Acute cadmium chloride administration induces hepatic and renal CYP2A5 mRNA, protein and activity in the mouse: involvement of transcription factor NRF2 [J]. Toxicol Lett, 2004, 148(3):199-210.

[31] Dong J, Sulik KK, Chen SY. Nrf2-mediated transcriptional induction of antioxidant response in mouse embryos exposed to ethanol in vivo: implications for the prevention of fetal alcohol spectrum disorders [J]. Antioxid Redox Signal, 2008, 10(12):2023-33.

[32] Bardag-Gorce F, Oliva J, Lin A, et al. Proteasome inhibitor up regulates liver antioxidative enzymes in rat model of alcoholic liver disease [J]. Exp Mol Pathol, 2011, 90(1):123-130.

[33] Yeligar SM, Machida K, Kalra VK. Ethanol-induced HO-1 and NQO1 are differentially regulated by HIF-1alpha and Nrf2 to attenuate inflammatory cytokine expression [J]. J Biol Chem, 2010, 285(46):35359-35373.