分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)證候研究中的應(yīng)用探討

牛曉紅

(中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700)

分子生物學(xué)是從分子水平去探討人類生命規(guī)律的一門學(xué)科。近年來，基因工程制藥、基因治療法等分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，在各個領(lǐng)域均取得了理想的效果。但在中醫(yī)臨床和基礎(chǔ)研究中，如何科學(xué)地將分子生物技術(shù)運用到中醫(yī)證候、中藥作用機制等相關(guān)研究中，發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢已成為中醫(yī)藥工作者不斷思考和探索的關(guān)鍵問題。隨著人們對于中醫(yī)藥的重視，許多研究人員運用現(xiàn)代化的新觀念和新技術(shù)開始對中醫(yī)藥進行研究，并已成功地將分子生物技術(shù)運用于中醫(yī)證候研究中，這將有利于從分子水平去研究中醫(yī)理論、疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律以及有針對性地研制中藥，更好地發(fā)揮中醫(yī)辨證施治的臨床作用，從而更好地為人類健康服務(wù)。

1 中醫(yī)證候與分子生物學(xué)理論層次高度關(guān)聯(lián)

中醫(yī)是我國醫(yī)學(xué)界的重要分支，治療過程中主要以辨證施治和加減藥物治療為主，在臨床上取得了理想的效果，這也成為中醫(yī)賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)，這兩個基礎(chǔ)均依賴于中醫(yī)證候。從中醫(yī)角度來說，“陰陽失調(diào)，百病叢生”，許多疾病的發(fā)生均由陰陽失調(diào)所致，察陰陽而調(diào)之也成為中醫(yī)臨床診斷、治療的基本原則和基本方法。中醫(yī)認為腎是人的根本，它決定了人的生長、發(fā)育、體質(zhì)、疾病等，但是其先天因素又同樣受到后天因素的影響和調(diào)節(jié)。從現(xiàn)代分子生物學(xué)角度來說，一個人基因是其生存和發(fā)育的主要因素，它決定人的生老病死，但是基因又不是全部，它同樣受到人類的生活、環(huán)境、習(xí)慣等影響。綜上所述，兩者在概念上存在著許多相似之處，這也為從分子水平對疾病的本質(zhì)進行深入探討指明了新的發(fā)展方向。而從分子角度對疾病進行研究分析，能填補中醫(yī)證候微觀還原分析的一些空白之處，因此醫(yī)學(xué)界利用分子生物學(xué)理論和技術(shù)研究中醫(yī)證候便顯得至關(guān)重要。

2 分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展使中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)研究成為可能

從中醫(yī)角度來說“有諸于內(nèi)必形諸于外”，這句話的意思就是當(dāng)人內(nèi)在功能等發(fā)生紊亂時，必然在人的外表中體現(xiàn)出來，通過外部彰顯內(nèi)在的聯(lián)系，這樣就能夠通過外在去尋找內(nèi)在的證候，從基因的多態(tài)性演變?yōu)榉肿拥穆?lián)系性。自分子生物學(xué)技術(shù)誕生后，可以通過分子生物學(xué)技術(shù)手段對人體的一些疾病證候、健康狀態(tài)等進行研究，發(fā)現(xiàn)人當(dāng)前狀態(tài)和基因表達譜上存在的差異，從而說明不同證候狀態(tài)下分子生物學(xué)層次的差異。換言之，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究同一疾病的不同證候和同一證候不同的疾病，以及同一個體不同狀態(tài)等之間的基因差異，能夠找出其共同點和不同點，針對基因突變和異常表達與疾病的關(guān)系進行分析，為中醫(yī)證候研究提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)，同時為中醫(yī)異病同治、同病異治等理論提供有力的依據(jù)。另外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，利用分子生物學(xué)技術(shù)能夠研究細胞內(nèi)基因表達，而基因表達是通過DNA控制蛋白質(zhì)的合成來表現(xiàn)的。因此，分子生物學(xué)對于蛋白質(zhì)研究在技術(shù)上的突破將為證候與蛋白質(zhì)的結(jié)合研究奠定基礎(chǔ)。在這一方面，有關(guān)蛋白質(zhì)芯片的深入研究、納米技術(shù)的使用，將為蛋白質(zhì)的研究、中醫(yī)證候的研究提供發(fā)展的契機[1]。

3 中醫(yī)證候特征與基因多態(tài)性研究

中醫(yī)證候是機體在疾病發(fā)展過程中的某一階段的病理概括，眾多學(xué)者認為中醫(yī)證候與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病必然有其內(nèi)在的本質(zhì)聯(lián)系,尤其體現(xiàn)在基因組學(xué)領(lǐng)域。利用分子雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)、分子克隆、基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)使基因診斷和基因治療得以實現(xiàn)，而芯片技術(shù)的出現(xiàn)又使它們在快速、準(zhǔn)確等方面得以提高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及對中醫(yī)證本質(zhì)認識的深入,中醫(yī)證候研究已經(jīng)從癥狀、體征為主體發(fā)展到目前的分子基因水平。

中醫(yī)證候具有整體性、時空性、傳變性和個體差異4個特征。許多基因具有的多態(tài)性變化與某些疾病的發(fā)生有密切相關(guān)性，而某一病癥的不同中醫(yī)證候發(fā)生頻率在一定范圍內(nèi)的分布則是相對穩(wěn)定的，中醫(yī)臨床證候的多樣性和復(fù)雜體系正好是基因多態(tài)性與臨床表型多樣性關(guān)系的最好研究對象[2]。近年來，在證候的基因多態(tài)性研究中也取得了一些成果。如唐發(fā)清等[3]報道了高血壓病肝陽上亢證與酪氨酸羥化酶(TH)基因擴增有關(guān)。歐陽濤等[4]研究發(fā)現(xiàn)，ApoE第一內(nèi)含子增強子BxpL1位點的G/G基因型可能是冠心病及冠心病痰證及痰瘀互阻證的易感基因之一。陳衛(wèi)衡等[5]通過ApoAI、B基因多態(tài)性與非創(chuàng)傷性股骨頭壞死證候相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，ApoAI基因啟動子-75bp位點多態(tài)性、啟動子-內(nèi)含子位點多態(tài)性及ApoB基因XbaI基因型，與非創(chuàng)傷性股骨頭壞死證候分型有一定相關(guān)性。謝毅強等[6]通過2型糖尿病大血管病變患者脂代謝紊亂與ApoE基因多態(tài)性及中醫(yī)證候的研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大血管病變患者的血脂隨著病情的加重和病程的延長存在不同程度的異常,各種中醫(yī)證候之間脂代謝的差異與ApoE基因的多態(tài)性有一定關(guān)系。這些研究結(jié)果提示，疾病有關(guān)基因多態(tài)性與中醫(yī)證候多樣性及發(fā)生頻率的規(guī)律性間可能存在某種關(guān)聯(lián)。

4 中醫(yī)臨床與分子生物學(xué)

臨床上利用分子生物學(xué)技術(shù)對相關(guān)疾病基因進行干預(yù)和分析，從而有效地探討中藥作用的分子機理與作用靶點。吳志奎等[7]研究顯示，補腎生血藥(方藥組成：山茱萸、熟地黃、龜板膠、阿膠等藥物組成)能有效提高貧血患者體內(nèi)的血紅蛋白和抗堿血紅蛋白，提高血紅蛋白的珠蛋白鏈比值，其作用機理可能是補腎生血藥能提高珠蛋白鏈γ/β+γ比值,促進γ-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達,誘導(dǎo)HbF合成,從而代償β-珠蛋白基因功能的缺陷。謝金錦等[8]研究了補陽還五湯對球囊擴張主動脈后再狹窄其內(nèi)皮血小板衍化生長因子的影響，實驗結(jié)果顯示，補陽還五湯能夠增加人體動脈內(nèi)皮SOD-1基因表達，有效地改善血灌注供氧能力，同時這種中藥還能夠有效地抑制血小板衍化生長因子受體的mRNA表達，從而控制細胞等病理性繁衍、增殖等。從分子生物學(xué)角度可以看出，補陽還五湯能夠有效地調(diào)節(jié)人體平衡，而并不是簡單的單因子作用。張國強等[9]利用分子生物學(xué)技術(shù)對丹參治療狼瘡性腎炎效果及其影響等進行了研究，實驗結(jié)果顯示，丹參能夠有效地抑制人體腎臟纖維等相關(guān)細胞的增殖，并能夠提高C-myc蛋白高水平而誘導(dǎo)細胞死亡。因此，臨床在治療狼瘡性腎炎及肝硬化等疾病時丹參能夠發(fā)揮重要作用。

5 中藥與分子生物學(xué)

分子生物學(xué)技術(shù)自創(chuàng)立以來在醫(yī)學(xué)中廣泛使用，在中藥相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用也越來越受到重視。

5.1 分子生物學(xué)技術(shù)在中藥作用機理研究中的應(yīng)用

中藥是臨床上使用較多的一線藥物，患者用藥后藥物能夠直達病灶，有效地緩解病情。但醫(yī)學(xué)界對于中藥的作用機理并不完全知曉，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在中藥研究中的不斷應(yīng)用，能夠有效地探討中藥的作用機理。患者服用中藥后，中藥的作用環(huán)節(jié)和生命分子之間存在或多或少的聯(lián)系，當(dāng)中藥發(fā)揮作用時必然會引起遺傳信息的改變，而決定其改變基礎(chǔ)的則是基因。根據(jù)近年來的相關(guān)研究結(jié)果初步顯示，中藥的作用與其生物活性成分調(diào)控基因的表達有關(guān)。我國科研人員曾對人參、黃芪、淫羊藿、靈芝等藥物在人體細胞因子中調(diào)控人體免疫功能等進行實驗[10]。曹穎英等[11]在研究淫羊藿甙促進小鼠脾細胞IL-3mRNA及IL-6mRNA的表達中發(fā)現(xiàn),患者服用中藥后，藥物能夠有效地誘導(dǎo)淋巴細胞IL-3mRNA、IL-6mRNA等遺傳基因的表達，且藥物的促進作用與患者藥物劑量關(guān)系密切。陳記藩等[12]進行了1項實驗，實驗中采用分子生物學(xué)技術(shù)研究通痹靈，結(jié)果顯示，中藥能夠降低患者體內(nèi)mRNA水平，通痹靈在治療過程中能夠有效地抑制滑膜細胞內(nèi)異常升高的TNF-αmRNA表達，降低TNF-αmRNA水平。唐咸玉等[13]用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)方法測定各組大鼠心肌N-rasmRNA的含量，發(fā)現(xiàn)ras癌基因在心肌肥厚形成發(fā)展過程中起到一定作用， 中醫(yī)活血祛痰治法可逆轉(zhuǎn)心肌肥厚， 其治療機理可能是抑制了心肌ras原癌基因的高表達。

近年來采用基因芯片技術(shù)對中藥復(fù)方進行了研究,以往采用傳統(tǒng)研究方法僅限于中藥復(fù)方某一方面或幾方面的作用研究,很難對該復(fù)方有全面的認識,尤其是對新功能的認識和開發(fā)。而應(yīng)用基因芯片技術(shù)能夠迅速了解該復(fù)方對基因組中某些基因表達的影響,從而不僅了解該復(fù)方的原有功能,還有可能很輕易地發(fā)現(xiàn)該復(fù)方組方后可能出現(xiàn)的新功能,為復(fù)方的新功能開發(fā)提供客觀依據(jù)。

5.2 分子生物學(xué)技術(shù)與中藥資源

近年來，隨著我國醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)在中藥資源等方面也做出了杰出的貢獻。當(dāng)前，我國很多野生中藥資源都瀕臨滅絕，且很多人工栽培的中藥品質(zhì)不高，使得臨床使用中成藥存在很大困難。因此臨床上采用藥用植物轉(zhuǎn)基因等技術(shù)能夠?qū)ο嚓P(guān)植株進行良種繁殖，有效地提高藥材質(zhì)量，并能夠獲得化合物能力更強的突變植株。胡之璧等[14]應(yīng)用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)進行洋地黃培細胞的生物轉(zhuǎn)化研究，篩選出高產(chǎn)細胞并獲得了相當(dāng)好的遺傳穩(wěn)定性。另外已培養(yǎng)出抗癌活性成分三尖杉酯含量高于原植物的三尖杉培養(yǎng)細胞[15]。研究發(fā)現(xiàn)栝樓中的天花粉蛋白強烈抑制HIV病毒和很多其他病毒，具有顯著的臨床效果，其需求量日益增大，現(xiàn)在其編碼基因已被克隆，并在大腸桿菌中高效表達。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使利用轉(zhuǎn)基因動物獲得像麝香、牛黃、犀牛角等一些動物性中藥成為可能，從而大大節(jié)省了資源，保護了這些瀕危的動物。

5.3 分子生物基因芯片技術(shù)在中藥篩選和新藥研發(fā)中的應(yīng)用

隨著醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，我國基因研究也進入到后基因時代，在后基因時代的中藥、證候研究中，隨著基因結(jié)構(gòu)和功能研究的突破，致病基因的發(fā)現(xiàn)，藥物的研究目標(biāo)之一是在基因水平上尋找藥物靶標(biāo)，通過比較藥物處理前后細胞基因表達的差異來推測篩選藥物作用的靶標(biāo)，從而找到“導(dǎo)向藥物”。目標(biāo)之二是用基因芯片技術(shù)檢測藥物的毒性或副作用，進行毒理研究。而生物芯片技術(shù)所具有的高集成與組合化學(xué)相結(jié)合，為新藥研究的初篩提供超高通量篩選。

Clarke等[16]采用基因芯片研究了腸癌患者化療前和治療期間腫瘤基因表達情況,發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶治療均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表達增加。該研究提示,這類研究既有助于闡明藥物的作用機制,也有助于確定藥物作用的靶基因,篩選出有效中藥及其有效成分，為新藥研究提供線索。隨著芯片技術(shù)的不斷發(fā)展以及在藥物開發(fā)、靶標(biāo)尋找等方面的廣泛應(yīng)用，將有利于確定中藥的有效活性成分和有效活性部位，為開發(fā)中藥新藥提供一個簡便、快捷的新途徑。

6 結(jié)語

綜上所述，中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)的揭示已成為制約中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究和發(fā)展的瓶頸之一。然而，中醫(yī)證候特征與基因多態(tài)性理論在理論層面給予了我們許多具有探索價值的啟示，特別是分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使我們從分子生物學(xué)角度解釋中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)成為可能，許多學(xué)者的探索也取得了階段性進展。但相關(guān)研究仍處于初級階段，臨床上對于中醫(yī)證候的認識還不十分完全，因此中醫(yī)證候及中藥作用機制等方面的研究尚需我們進一步的探討和完善。

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