MicroRNAs與動脈粥樣硬化①

曹幸毅，袁明，夏東暉，吳士文

MicroRNAs與動脈粥樣硬化①

曹幸毅1，袁明2，夏東暉1，吳士文1

哺乳動物細胞內(nèi)microRNAs(miRNAs)的發(fā)現(xiàn)使對疾病研究的重點轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制方面。在心血管系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)多種miRNAs與動脈粥樣硬化病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文從動脈粥樣硬化各大學(xué)說板塊的角度，綜述miRNAs在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的作用和進展。

microRNA；動脈粥樣硬化；血管內(nèi)皮細胞；炎癥；綜述

[本文著錄格式] 曹幸毅，袁明，夏東暉，等.MicroRNAs與動脈粥樣硬化[J].中國康復(fù)理論與實踐,2014,20(5):446-450.

20世紀90年代以前，microRNAs(miRNAs)被認為是只在非哺乳動物物種內(nèi)表現(xiàn)相關(guān)功能的小分子RNAs，一直未受到學(xué)者的廣泛重視。Ambros和他的同事們發(fā)現(xiàn)在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)內(nèi)存在一種lin-4基因，能夠參與調(diào)控幼蟲的生長進程，迅速改變了之前的觀點。lin-4基因的功能是不編碼蛋白，但可生成一對小的RNA轉(zhuǎn)錄本，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用[1]。此后在線蟲內(nèi)發(fā)現(xiàn)了另一個miRNA，let-7[2]，同樣被證明具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能。至2002年，哺乳動物內(nèi)的miRNAs開始逐漸被認識，并發(fā)現(xiàn)其與人類疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。近幾年來，隨著miRNAs研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生發(fā)展過程中占有重要的地位。本文從AS各學(xué)說出發(fā)，就miRNAs在AS發(fā)病機制中的地位和進展進行綜述。

1 miRNAs的生物學(xué)特性

miRNAs是生物體內(nèi)長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3'端非編碼區(qū)完全或不完全的互補結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或翻譯抑制[3-5]。它作為一類非編碼的小分子RNA，參與調(diào)控30%～50%基因的轉(zhuǎn)錄和表達[6]，影響細胞的發(fā)育、增殖、分化、生長、代謝和凋亡等。

在基因組中，miRNAs作為初級轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNAs)，包含5'端帽結(jié)構(gòu)和3'端多聚腺苷尾巴。首先，Pri-miRNAs在細胞核內(nèi)被一種名為Drosha的RNA聚合酶Ⅲ切割，形成長60～70堿基含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA。在exportin-5蛋白的幫助下，pre-miRNA從細胞核轉(zhuǎn)運進入細胞質(zhì)，由Dicer切割莖環(huán)，形成雙鏈小RNA。雙鏈RNA解體，形成成熟miRNA。成熟miRNA選擇性結(jié)合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing comples,RISC)裝配形成miRISC，最后完全或不完全匹配靶基因的3'非翻譯區(qū)(untranslated regions,UTR)，降解靶mRNA或抑制靶蛋白翻譯[7]。

2 miRNAs與AS

AS是心腦血管病、頸動脈病和周圍血管病發(fā)生的主要原因。它是由脂質(zhì)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞完整性破壞，平滑肌細胞和成纖維細胞增生，可廣泛累及全身各個動脈的硬化性血管病，嚴重危害人類的健康。自從1859年瑞典內(nèi)科學(xué)家B.W.Johansson和病理學(xué)家P.Nichol最先報道冠心病以來，已有150年的歷史，積累了20多萬篇研究報告。研究者試圖從不同層面解釋這一疾病的發(fā)病機制，先后出現(xiàn)過多種學(xué)說，如損傷反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)浸潤、氧化應(yīng)激和斑塊破裂等。現(xiàn)在認為，AS是一種在眾多危險因素和遺傳因素共同作用下，所引起的充滿脂質(zhì)的多灶性、淤積性炎癥免疫性疾病。miRNAs的發(fā)現(xiàn)更好地詮釋了AS的發(fā)生機制，為這一疾病的診治研究開辟了良好的前景。

2.1 損傷反應(yīng)學(xué)說

AS損傷反應(yīng)學(xué)說是指在各種有害因素反復(fù)刺激下，動脈內(nèi)膜損傷是AS病發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。當(dāng)內(nèi)皮損傷或剝脫后，會產(chǎn)生一系列反應(yīng)：首先中膜平滑肌細胞介導(dǎo)纖維性增殖，負責(zé)修復(fù)及愈合；如果致AS危險因素持續(xù)存在，則會引發(fā)遷入內(nèi)膜的平滑肌細胞和單核/巨噬細胞攝取血液中負荷的脂質(zhì)，最后形成泡沫細胞；同時，損傷內(nèi)皮導(dǎo)致血小板聚集，產(chǎn)生多種血管活性介質(zhì)等。這一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)和惡性循環(huán)促成AS的發(fā)生。

2.1.1 miRNAs與內(nèi)皮細胞 內(nèi)皮細胞在血管發(fā)育過程中高度增殖、活躍。血管成熟后，內(nèi)襯血管壁的內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)為靜止，細胞與細胞之間緊密連接，構(gòu)成血液和組織之間的穩(wěn)定屏障，維持血管穩(wěn)態(tài)。此外，內(nèi)皮細胞不斷感知和響應(yīng)環(huán)境的變化，合成和分泌多種血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管張力，抵抗血栓形成及介導(dǎo)免疫應(yīng)答等。

現(xiàn)在認為，內(nèi)皮細胞損傷是AS發(fā)生和發(fā)展的早期事件[8]。內(nèi)皮細胞功能失調(diào)，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管擴張，通透性增加，趨化因子和黏附分子的表達上調(diào)，內(nèi)皮細胞的增殖能力下降，共同引發(fā)AS。

Yang等利用基因敲除技術(shù)敲除Dicer基因，發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎在妊娠第12.5天和第14.5天死亡，其血管形成和維持受到嚴重影響，表明小鼠胚胎血管生成可能要通過miRNAs調(diào)控得以實現(xiàn)[9]。在RNA干預(yù)人內(nèi)皮細胞沉默Drosha和Dicer1的模型中，內(nèi)皮細胞的遷移、毛細血管出芽和管腔形成受到顯著影響，進一步證實miRNAs與內(nèi)皮細胞功能密切相關(guān)[10-11]。Stahlhut等在斑馬魚的發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)，miR-1、miR-206通過直接調(diào)節(jié)肌肉中的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)A的水平實現(xiàn)調(diào)控內(nèi)皮細胞血管生成信號的強度[12]。miR-126在內(nèi)皮細胞特異性表達，在新生血管和血管完整性方面扮演重要的角色。靶向敲除miR-126的老鼠由于血管完整性和內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管生成功能的缺失，會出現(xiàn)血管滲漏、出血，甚至部分胚胎死亡；而miR-126促血管生成和維持的作用主要通過抑制轉(zhuǎn)錄因子SPRED-1和PIK3R2的表達，促進VEGF和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)而發(fā)揮作用[13]。

由內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)產(chǎn)生的一氧化氮在維持心血管穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色。在各種病理條件下，表達異常的eNOS常常會造成內(nèi)皮功能失調(diào)和心血管疾病形成。Sun等證明，eNOS是miR-155的直接目標，過表達miR-155減少人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的eNOS表達和一氧化氮產(chǎn)生，降低人乳動脈乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張[14]，提示抑制miR-155可能是改善心血管疾病發(fā)展中血管內(nèi)皮功能障礙的一種新的治療方法。

內(nèi)膜損傷也常發(fā)生于血管成形術(shù)、動脈內(nèi)膜切除術(shù)和動脈移植等。Sabatel等利用體外血管生成實驗，觀察到miR-21起著負性調(diào)節(jié)血管生成的作用，通過減少RhoB表達和活力，減弱內(nèi)皮細胞遷移和管腔新生[15]。Iaconetti等研究miR-92a在血管損傷后重塑的作用[16]。5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromouracil deoxyriboside,BrdU)摻入和傷口愈合實驗提供的證據(jù)表明，抑制miR-92a的功能能夠增加內(nèi)皮細胞的增殖和遷移；功能實驗表明，它可能是通過調(diào)控血管內(nèi)皮細胞Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)和絲裂原活化蛋白激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase 4,MKK4)的表達水平發(fā)揮作用；在老鼠體內(nèi)注射miR-92拮抗劑顯著增強受傷頸總動脈的再內(nèi)皮化，減少動脈球囊損傷或動脈支架植入后新生內(nèi)膜的形成。

總之，研究表明，miRNAs在血管生成和內(nèi)皮細胞完整性方面發(fā)揮重要作用。

2.1.2 miRNAs與平滑肌細胞 平滑肌細胞是動脈血管中唯一的細胞成分，有收縮型和合成型兩種表型。在健康成人血管內(nèi)，分化的平滑肌細胞是靜止的且具有收縮功能；當(dāng)機體損傷時，可以通過轉(zhuǎn)換表型引起細胞增殖、遷移和分泌基質(zhì)，而血管平滑肌細胞的增殖和遷移會導(dǎo)致AS和新生內(nèi)膜的形成。

近年來，miRNAs已被證明與平滑肌的增殖和表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控密切相關(guān)。miR-143/145是豐富表達于平滑肌細胞的兩個高度保守的miRNA編碼的雙順反子基因簇，通過一些轉(zhuǎn)錄因子如血清反應(yīng)因子、共激活因子、心肌素和心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等，對平滑肌細胞的分化起到至關(guān)重要的作用[17-18]。miR-145還可以通過增加收縮蛋白的表達，使各種非平滑肌類細胞轉(zhuǎn)變成平滑肌類細胞，這可能因為miR-145可直接刺激心肌素的翻譯或抑制心肌素的抑制因子KLF4和KLF5的轉(zhuǎn)錄[19-20]。動物實驗表明，miR-143/145缺陷老鼠，中間層動脈平滑肌較薄，部分去分化，嚴重干擾平滑肌的穩(wěn)態(tài)[18,21-22]。

miR-195也大量表達于血管平滑肌細胞。Wang等在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，miR-195可以抑制平滑肌細胞的增殖和遷移，同時減少白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和IL-8等炎癥因子的合成[23]。此外，Yu等研究表明，轉(zhuǎn)染Let-7d的血管平滑肌細胞表達KRAS蛋白低下，細胞增長減慢，大部分細胞停滯于生長周期的G1期[24]。miR-1/133、miR-24、miR-26a、miR-208和miR-155等都有報道與平滑肌細胞調(diào)控有關(guān)。

2.1.3 miRNAs與單核、巨噬細胞 巨噬細胞在AS發(fā)病中也起著關(guān)鍵作用。在AS發(fā)生早期，巨噬細胞的清道夫作用可以清除內(nèi)膜中致動脈粥樣病變的脂蛋白；但負荷過度導(dǎo)致細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚、泡沫細胞形成，促使炎癥反應(yīng)發(fā)生。miRNAs通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的信號途徑調(diào)控巨噬細胞的分化和活力。

miR-155特異性表達于AS斑塊處和巨噬細胞。沉默內(nèi)源性miR-155后，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞脂質(zhì)攝取能力顯著增加，清道夫受體表達上調(diào)，并促進IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等趨化因子的釋放[25]。Noels等發(fā)現(xiàn)，在AS傷口處的巨噬細胞缺乏miR-155，減少招募單核細胞至動脈粥樣斑塊處的趨化因子CCL2的表達；并且可以直接抑制轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的表達，減輕促炎癥因子核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號途徑[26]。近來，通過細菌脂多糖刺激Toll樣受體(TLR)信號途徑，可促進巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚，泡沫細胞形成。一些miRNAs可調(diào)控TLR信號途徑，如miR-146a靶向TLR4抑制脂質(zhì)積聚和炎癥反應(yīng)，而miR-147則為負性調(diào)控[27]。

2.2 炎癥反應(yīng)學(xué)說

Ross在損傷-反應(yīng)假說的基礎(chǔ)上指出，AS是一種血管壁的慢性炎癥反應(yīng)，在其全過程中，不論局部還是全身都表現(xiàn)出炎癥所有的基本特征。高膽固醇血癥、氧化型低密度脂蛋白、高血壓、糖尿病等各種危險因素長時間反復(fù)作用于血管壁，通過炎性介質(zhì)的分泌、炎性細胞的活化，促使AS形成。通常，靜止?fàn)顟B(tài)下的內(nèi)皮細胞不表達黏附分子，但是一些細胞因子使得內(nèi)皮細胞活化后可表達血管細胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule,VCAM)，介導(dǎo)白細胞黏附。內(nèi)皮細胞表達的miR-126能夠抑制VCAM-1的表達，減少白細胞黏附于內(nèi)皮細胞，減輕血管炎癥[28]。Zhou等通過振動剪切應(yīng)力誘導(dǎo)miR-21過表達，發(fā)現(xiàn)miR-21也能增加VCAM-1、單核細胞趨化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)等黏附分子的表達，促進單核細胞與內(nèi)皮細胞之間的黏附[29]。在主動脈弓等AS易發(fā)地帶，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞源性的miR-10a表達低下，而其靶基因HOXA1的表達上調(diào)；通過內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)錄組基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)敲除miR-10a的原代人主動脈內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出NF-κB介導(dǎo)的炎癥過程，并且觀察到一些炎癥生物標記MCP-1、IL-6、IL-8等增加[30]。miR-181b調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞激活NF-κB介導(dǎo)的血管炎癥反應(yīng)，過表達miR-181b抑制NF-κB結(jié)合蛋白importin-α3和一系列NF-κB應(yīng)答基因，如VCAM-1和E-選擇素[31]。miR-155作為負反饋環(huán)路的一部分，下調(diào)炎癥性細胞因子的產(chǎn)生，減少AS進展。還發(fā)現(xiàn)miR-155介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)相關(guān)，主要靶向針對MAPK-10[32]。

IL-10是一種強有效的抗炎分子。有研究證明IL-10依賴的miR-187直接針對TNF-α mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，并且通過調(diào)控IkBζ間接減少IL-6和IL-12p40的轉(zhuǎn)錄表達[33]。

2.3 氧化應(yīng)激學(xué)說

氧化應(yīng)激學(xué)說是AS形成學(xué)說中的重要部分。當(dāng)機體遭受各種有害刺激時，體內(nèi)或細胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生與抗氧化之間失衡，從而導(dǎo)致組織損傷?；钚匝跛缴呖芍苯邮沟兔芏戎鞍?LDL)氧化成氧化低密度脂蛋白(oxLDL)。而oxLDL被視為AS形成和發(fā)展過程中的一個重要風(fēng)險因素，它可以引起動脈壁內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、樹突細胞及平滑肌細胞的一系列致AS級聯(lián)反應(yīng)。

Qin等研究了oxLDL刺激后miRNAs與內(nèi)皮細胞凋亡之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-365的一個靶基因為抗凋亡蛋白Bcl-2，轉(zhuǎn)染miR-365抑制劑的細胞顯示Bcl-2 mRNA和蛋白水平上調(diào)，細胞凋亡減少[34]。隨后又發(fā)現(xiàn)Let-7c通過直接抑制Bcl-XL表達，調(diào)控內(nèi)皮細胞活性[35]。Ding等利用hsa-let-7g預(yù)處理暴露于ox-LDL的血管平滑肌細胞，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生減少，細胞自噬和凋亡下降；在高脂飲食大鼠的主動脈節(jié)段處也得到相同的結(jié)果[36]。

2.4 脂質(zhì)浸潤學(xué)說

以往認為，AS是脂肪沉積和平滑肌細胞增殖性疾病。目前則傾向于是一個動態(tài)演變的過程，此過程開始于動脈壁氧化脂質(zhì)的積累和內(nèi)皮功能的失調(diào)。脂質(zhì)累積部位集聚的單核細胞對氧化脂質(zhì)的攝取，加速了單核細胞向巨噬細胞的轉(zhuǎn)變，也加速了充滿脂質(zhì)的泡沫細胞形成，久之形成病變核心。LDL、脂蛋白(LP)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL)是最早確定的與AS發(fā)生過程相關(guān)的危險因素。

脂蛋白脂肪酶(LPL)是一種參與甘油三酯水解的限速酶，巨噬細胞源性LPL顯示能促進AS進展。miR-467b能夠調(diào)節(jié)肝臟LPL的表達，并在肥胖小鼠脂肪變性或血脂異常方面起了重要的作用。Tian等利用oxLDL處理轉(zhuǎn)染了miR-476b類似物或抑制劑的RAW264.7巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)miR-467b通過LPL顯著減少脂質(zhì)積聚和IL-6、IL-1β、TNF-α等的分泌[37]。

HDL具有防止動脈內(nèi)膜脂質(zhì)堆積，抑制AS病變形成的作用。相比miR-33+/+ApoE-/-老鼠，miR-33和ApoE基因都敲除的老鼠體內(nèi)出現(xiàn)高水平循環(huán)HDL，伴膽固醇逆轉(zhuǎn)運能力提高，證明miR-33缺乏能升高HDL，促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運，以清除動脈壁多余的脂質(zhì)[38]。miR-125a-5p通過其靶目標，參與脂質(zhì)代謝的氧固醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白9(oxysteml-binding protein-related protein 9,ORP9)，抑制脂質(zhì)單核細胞攝取脂質(zhì)[39]。miR-146a抑制TLR4依賴的細胞內(nèi)信號途徑，減少胞內(nèi)膽固醇含量、脂質(zhì)攝取和炎癥因子的分泌[34]。

2.5 斑塊破裂學(xué)說

AS斑塊因破裂或糜爛導(dǎo)致的血栓形成，是嚴重心腦血管事件發(fā)生的重要機制。富含脂質(zhì)的核心與血流分離的纖維帽中存在缺損或裂隙，暴露斑塊中致血栓性的核心。人AS斑塊特異性表達miRNAs，在斑塊不穩(wěn)定和破裂演變發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[40]。Lovren等利用慢病毒轉(zhuǎn)染miR-145的ApoE-/-老鼠，經(jīng)過12周西方飲食，發(fā)現(xiàn)其主動脈竇、升主動脈和頭臂動脈等處的斑塊面積顯著減少；纖維帽面積和斑塊膠原成分增加，壞死核心區(qū)域減少，斑塊處巨噬細胞成分減少，從而穩(wěn)定斑塊[41]。在LDL受體敲除老鼠，通過抑制miR-33，可以發(fā)現(xiàn)斑塊面積減少，穩(wěn)定性增加，而這是由于提高了循環(huán)HDL水平和逆向膽固醇運輸。

在纖維帽薄弱處和部分受損處含有豐富的激活的免疫細胞，產(chǎn)生很多炎癥分子和蛋白水解酶，使斑塊轉(zhuǎn)變成脆弱、不穩(wěn)定、易破裂的結(jié)構(gòu)。miR-155是炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)器。雖然miR-155被認為是一種促炎癥的小分子RNA，但是體外研究顯示在脂質(zhì)負載的細胞內(nèi)發(fā)揮抗炎作用。Marjo等通過活體骨髓移植miR-155缺陷到高脂血癥小鼠，證實造血不足的miR-155增加AS斑塊的發(fā)展，減少斑塊的穩(wěn)定性；同時發(fā)現(xiàn)斑塊處的炎癥粒細胞增加[42]，表明miR-155在高脂血癥老鼠模型中扮演著抗炎、抗AS的作用。

3 結(jié)論

miRNAs的研究使我們從基因調(diào)控方面更好地認識AS的發(fā)生與發(fā)展。miRNAs的特點是靶向針對多個功能相關(guān)的基因或單個基因，所以，miRNAs是潛在的強有效的治療工具。然而，miRNAS在AS這一領(lǐng)域的研究還剛剛起步，仍存在許多問題有待學(xué)者們進一步探索，特別是篩選出干預(yù)AS進程和可用于治療的miRNAs等。

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MicroRNAs and Atherosclerosis(review)

CAO Xing-yi,YUAN Ming,XIA Dong-hui,et al.Department of Neurology,Chinese People's Army Police Force General Hospital,Beijing 100039,China

The discovery of microRNAs(miRNAs)in mammalian cells has renewed the focus on posttranscriptional regulatory mechanisms during pathogenesis.The studies have showed that miRNAs play a key role in atherosclerosis development and progress,and were reviewed in this paper.

microRNA;atherosclerosis;vascular endothelial cell;inflammation;review

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.05.013

R543.5

A

1006-9771(2014)05-0446-05

2013-10-19

2013-11-20)

1.中國人民武裝警察部隊總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京市100039；2.中國航天員科研訓(xùn)練中心，北京市100094。作者簡介：曹幸毅(1987-)，女，漢族，江蘇啟東市人，碩士研究生，主要研究方向：腦血管病。通訊作者：吳士文，男，博士，碩士研究生導(dǎo)師。