DNA甲基化在眼科疾病中的應(yīng)用以及中藥調(diào)節(jié)甲基化的研究進(jìn)展

吳文婷 金 明

2003年，伴隨著為期5年的人類表觀基因組計(jì)劃（Human Epigenome Project,HEP）正式啟動，醫(yī)學(xué)界將目光投向DNA甲基化在人類及其他生物的生理狀態(tài)以及疾病譜的作用的系統(tǒng)研究方面。經(jīng)過10年來的迅猛發(fā)展，DNA甲基化調(diào)節(jié)已經(jīng)成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)，為闡明疾病的發(fā)病機(jī)制提供了幫助，大量文獻(xiàn)證實(shí)特定基因DNA甲基化狀態(tài)的異常與眼科疾病密切相關(guān)。表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA序列的情況下，基因的表達(dá)與功能發(fā)生改變并產(chǎn)生可遺傳的表型。DNA甲基化（DNA methylation）作為一種表觀遺傳學(xué)的重要機(jī)制，是指由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化 S-腺苷基甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶的反應(yīng)，此調(diào)節(jié)在生命活動中發(fā)揮重要的作用〔1〕。目前，一些與表觀遺傳學(xué)相關(guān)的藥物正在臨床試驗(yàn)中，以期能找到調(diào)節(jié)表觀遺傳基因組的藥物而達(dá)到治療疾病的目的。而前期文獻(xiàn)表明，在胃癌、糖尿病腎病、硬皮病、抗衰老等方面，傳統(tǒng)中醫(yī)藥顯示了不可小覷的DNA甲基化調(diào)節(jié)作用。雖然其在眼科領(lǐng)域的治療還為一片空白，但有理由相信中藥具有通過調(diào)節(jié)甲基化方面的途徑治療眼科疾病的前景。

1 甲基化在眼科疾病中的應(yīng)用

1.1 葡萄膜惡性黑色素瘤

1.1.1 RASEF基因：RASEF位于9q21，與葡萄膜、皮膚黑色素瘤相關(guān)，起到抑癌基因的作用。Matt〔2〕等以11份葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞株和35份葡萄膜黑色素瘤組織為研究樣本，用高分辨率熔化曲線及消化分析篩選RASEF變異，RT-PCR測定RASEF表達(dá)，基因測序觀察RASEF基因啟動子甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明RASEF啟動子甲基化缺失，伴隨RASEF高表達(dá)，且RASEF基因的甲基化與存活率的減少存在關(guān)聯(lián)。說明葡萄膜黑色素瘤中抑癌基因啟動子甲基化是導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默、癌癥發(fā)生的原因。

1.1.2 hTERT基因：端粒的長短在染色體穩(wěn)定、細(xì)胞生長及衰老方面發(fā)揮重要的作用，端粒酶活性異常可使腫瘤細(xì)胞具有無限分裂的能力而發(fā)生癌變，人催化亞基端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是端粒酶的限速成分，與端粒酶活性相關(guān)，可催化TTAGGG重復(fù)序列至染色體末端的端粒，保證染色體在多次復(fù)制后，不會被降解〔3〕。Moulin〔4〕等采用甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析（methylationspecific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）和斑點(diǎn)免疫印跡法，對23例原發(fā)葡萄膜黑色素瘤的DNA進(jìn)行相關(guān)基因啟動子甲基化狀態(tài)的研究，發(fā)現(xiàn)hTERT基因啟動子甲基化的比例為52%。

1.1.3 RASSF1A基因：該基因坐落于3號染色體p21.3區(qū)，其編碼的蛋白與DNA修復(fù)蛋白XPA相互作用，抑制細(xì)胞周期蛋白D1的積累，從而阻滯細(xì)胞周期循環(huán)。Merhavi〔5〕等采用亞硫酸鈉修飾后甲基化PCR技術(shù)對20份原發(fā)性葡萄膜黑色素瘤樣本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因啟動子區(qū)存在高甲基化狀態(tài)改變，同時與腫瘤相關(guān)的BRAF基因變異缺失，說明此腫瘤形成中表觀調(diào)節(jié)占有重要地位，即抑癌基因啟動子高甲基化的表觀調(diào)節(jié)可能是葡萄膜黑色素瘤的形成機(jī)制。

1.1.4 TIMP3 基因：van der Velden〔6〕將原發(fā)性葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系和伴肝轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系對比研究，采用microarray分析1 176個基因，發(fā)現(xiàn)了63個表達(dá)異常的基因。再以甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-dC）去甲基化處理原發(fā)性葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)有19個基因因高甲基化存在表達(dá)抑制。其中，金屬蛋白酶組織抑制物-3（tissue metalloproteinase inhibitor 3，TIMP3）由 TIMP3 編碼，其蛋白產(chǎn)物是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的因子之一，因其DNA高甲基化異常狀態(tài)而導(dǎo)致相應(yīng)蛋白在轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)量下降5倍，表明TIMP3在葡萄膜黑色素瘤的發(fā)生，甚至是轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

1.1.5 p16（INK4a）基因：也被稱為 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A（CDKN2A），為重要的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因，該基因失活可導(dǎo)致細(xì)胞G1-S期功能失常，表現(xiàn)為細(xì)胞無限制增長，即腫瘤。van der Velden〔7〕發(fā)現(xiàn)，在50%的葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系以及32%的原發(fā)性葡萄膜黑色素瘤中，p16（INK4a)的啟動子存在高甲基化改變，相應(yīng)蛋白的表達(dá)缺失，且伴隨甲基化異常的腫瘤患者死亡率較高。使用5-Aza-dC去甲基化處理樣本后，p16（INK4a）mRNA恢復(fù)表達(dá)，說明在葡萄膜黑色素瘤中，啟動子的高甲基化導(dǎo)致p16基因表達(dá)沉默，甲基化抑制后該基因可重新表達(dá)。

1.1.6 CXCR4基因：趨化因子受體CXCR4在體內(nèi)大部分組織和器官上都有表達(dá)，它是由352個氨基酸組成的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），參與體內(nèi)多種生理機(jī)制，如腫瘤遷移等〔8〕。Li〔9〕等為了驗(yàn)證CXCR4啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與葡萄膜黑色素瘤肝臟轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，將LS174T克隆腫瘤細(xì)胞注射入免疫缺陷小鼠的前房、皮下、脾臟內(nèi)等誘發(fā)肝轉(zhuǎn)移，檢測發(fā)現(xiàn)前房起源的的LS174T腫瘤細(xì)胞的CXCR4的表達(dá)量相較于其他組和野生型低，其啟動子區(qū)（～2660 bp～2671 bp）的DNA幾乎完全甲基化，同時甲基轉(zhuǎn)移酶活性增高，在加入5-AzadC后，LS174T細(xì)胞的CXCR4恢復(fù)表達(dá)。

1.1.7 TRAIL 受體基因：TRAIL R1-R4（也被稱為 DR4、DR5、DcR1、DcR2）是最主要的4個人類腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand,TRAIL）的受體。有文獻(xiàn)表明，DR4啟動子區(qū)甲基化可降低葡萄膜黑色素瘤對干擾素介導(dǎo)的凋亡作用的敏感性〔10〕，DcR2在黑色素瘤中蛋白表達(dá)沉默〔11〕。 Venza〔12〕等以皮膚、葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系以及病理組織為樣本，進(jìn)行TRAIL受體的啟動子甲基化狀態(tài)等方面的觀察。結(jié)果表明，在皮膚、葡萄膜黑色素瘤的樣本中，DR4、DR5、DcR1和 DcR2的 DNA啟動子區(qū)皆存在明顯異常，但只有DcR1和DcR2的甲基化異常與蛋白表達(dá)有相關(guān)性，且用5-Aza-dC調(diào)節(jié)后，蛋白可重新表達(dá)。實(shí)驗(yàn)還表明，DNMT1活性與DcR2的高甲基化有關(guān)，而DNMT1和DNMT3a共同調(diào)節(jié)DcR1啟動子區(qū)的的甲基化狀態(tài)。

1.2 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤

1.2.1 RASSF1A基因：Cohen〔13〕等對 19例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣本亞硫酸氫鈉處理后以實(shí)時定量甲基化特異性PCR方法進(jìn)行啟動子甲基化狀態(tài)的研究，發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的RASSF1A的甲基化率為89%。

1.2.2 Rb2/p130基因：Rb2/p130是與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)的抑癌基因之一，由3853個核苷酸構(gòu)成，含有22個外顯子，位于16q12.2。Rb2/p130可介導(dǎo)與細(xì)胞蛋白如轉(zhuǎn)錄因子E2F、細(xì)胞周期蛋白或依賴性激酶相互作用，維持G0期細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄靜止，其基因的突變、缺失與許多惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔14〕。Tosi〔15〕等對10例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤研究發(fā)現(xiàn)，伴隨外顯子1突變，Rb2/p130啟動子CpG區(qū)出現(xiàn)甲基化改變，并決定了疾病的表型。用甲基化抑制劑5-Aza-dC處理后，Rb2/p130基因表達(dá)水平上升。

1.2.3 MGMT 基因 ：O6-methylguanine DNA methyltransferase（MGMT）基因位于染色體的10q26，為維持基因組的穩(wěn)定性發(fā)揮了重要作用。它可以修復(fù)并還原發(fā)生甲基化修飾的鳥嘌呤，避免DNA在復(fù)制及轉(zhuǎn)錄時發(fā)生錯配及誤差。Choy〔16〕等采用23份視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤標(biāo)本和2份視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（Y79 and WERI-Rb1）進(jìn)行與腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)的研究。結(jié)果表明35%的病理組織中可檢測到至少1處以上的MGMT區(qū)的高甲基化，相應(yīng)蛋白表達(dá)缺失，且該情況在低組織分化的瘤體中更常見。從以上推測出，MGMT基因啟動子甲基化后導(dǎo)致MGMT蛋白表達(dá)缺失與視網(wǎng)膜母與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。

1.3 年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）

1.3.1 IL-17RC基因：美國NIH的Wei〔17〕采用甲基化免疫共沉淀芯片技術(shù)測定（MeDIP-chip）對3對同卵雙胞胎（其中一個患有AMD，另一人健康）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AMD患者IL-17RC基因啟動子CpG區(qū)域存在DNA低甲基化改變。這一結(jié)論在多中心收集的大樣本AMD患者中得到驗(yàn)證。且相較于正常人，IL-17RC在AMD患者的視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜組織中高表達(dá)，揭示IL-17RC基因啟動子DNA低甲基化以及蛋白高表達(dá)是AMD患者所特有的現(xiàn)象。IL-17RC以跨膜蛋白形式存在于細(xì)胞膜上，作為共受體與IL-17亞型特異性結(jié)合，激活炎癥下游的多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響細(xì)胞因子等炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。IL-17還能上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的水平〔18〕，增加 VEGF mRNA 的表達(dá)。 而 VEGF與肝細(xì)胞生長因子（HGF）的聯(lián)合作用又可以提供正反饋信號，誘導(dǎo)IL-17RC增多〔19〕，放大了炎癥鏈級反應(yīng)，形成復(fù)雜的炎癥分子網(wǎng)絡(luò)。

1.3.2 GSTM1、GSTM5 基因：Hunter〔20〕等借助 Illumina 人類甲基化27平臺，對AMD和健康對照者尸體的視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）、脈絡(luò)膜進(jìn)行DNA甲基化的區(qū)別檢測，發(fā)現(xiàn)與年齡配對的健康人相比，AMD患者的GSTM1啟動子區(qū)存在高甲基化改變，導(dǎo)致RPE、脈絡(luò)膜以及神經(jīng)感覺層的 GSTM1和GSTM5的蛋白明顯降低，可能由此引發(fā)AMD患者視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激損傷。

1.4 老年性核性白內(nèi)障

CRYAA基因：CRYAA編碼一種晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白，對于保持晶狀體透明有重要作用。Zhou〔21〕等對15例老年性核性白內(nèi)障患者的晶狀體上皮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，其啟動子區(qū)CpG島存在高甲基化改變，以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平下調(diào)。用去甲基化試劑調(diào)節(jié)后，其表達(dá)恢復(fù)，提示老年性核性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞存在表觀遺傳調(diào)控改變。

1.5 翼狀胬肉

TGM2、MMP2、CD24 基因：Riau〔22〕等從翼狀胬肉患者的病變處和正常結(jié)膜處取材，采用亞硫酸鹽測序法比較了29種與基質(zhì)重構(gòu)、細(xì)胞黏附相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)異同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2（TGM-2）基因有3個CpG位點(diǎn)發(fā)生高甲基化改變，基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）和CD24分別存在2個和4個CpG位點(diǎn)的低甲基改變，且轉(zhuǎn)錄和蛋白水平也發(fā)生了相應(yīng)的調(diào)控變化。這3個基因的甲基化異?？蓪?dǎo)致成纖維細(xì)胞、新生血管的病變，從而引發(fā)翼狀胬肉的形成。

隨著表觀遺傳學(xué)研究的深入，相信在未來，越來越多的眼科疾病將會被證實(shí)與基因甲基化狀態(tài)異常密切相關(guān)。利用基因測序，識別出正常和錯誤的表觀基因組的組成和結(jié)構(gòu)，為運(yùn)用表觀遺傳學(xué)方法來治療疾病奠定了基礎(chǔ)。然而，表觀基因調(diào)節(jié)藥物仍處于前期開發(fā)階段。眾所周知，西藥的研發(fā)周期長，需耗費(fèi)大量的人力、資金，且結(jié)果也不一定樂觀。但是，中醫(yī)學(xué)有寶貴的天然藥材，以及豐富的理論，通過數(shù)千年的經(jīng)驗(yàn)傳承，已經(jīng)驗(yàn)證了臨床有效性，值得后人努力挖掘和證實(shí)其現(xiàn)代中藥藥理作用，以更加科學(xué)、邏輯的方式去解讀中藥有效性。而現(xiàn)代中醫(yī)研究者已經(jīng)運(yùn)用表觀遺傳學(xué)方法發(fā)現(xiàn)中藥對DNA甲基化存在調(diào)控作用。雖然，目前中藥調(diào)節(jié)DNA甲基化的作用在眼科領(lǐng)域鮮有報(bào)道，但是有理由認(rèn)為中藥具有通過調(diào)節(jié)甲基化而達(dá)到治療相關(guān)眼病的可能，以下內(nèi)容就中藥在癌癥、糖尿病腎病、硬皮病、抗衰老等方面調(diào)節(jié)DNA甲基化的研究進(jìn)展進(jìn)行論述，為其將來在眼科的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

2 中藥調(diào)節(jié)DNA甲基化的研究進(jìn)展

黃明明〔23〕等體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞，用不同濃度（0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L）白藜蘆醇孵育48 h 后，采用甲基化特異性 PCR（MSP）、RT-PCR、Western blot檢測RASSF1A基因啟動子區(qū)域的甲基化改變情況、mRNA表達(dá)以及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示白藜蘆醇能以劑量依賴性方式抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，隨著濃度的增加，RASSF1A甲基化的水平逐漸減弱，非甲基化水平逐漸增多。同時RASSF1A的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。提示白藜蘆醇對甲基化水平的調(diào)節(jié)，可能是其抗癌的重要因素。

硬皮病是表觀遺傳異常的多基因疾病，致病關(guān)鍵環(huán)節(jié)受表觀遺傳調(diào)節(jié)〔24〕。齊慶〔25〕等體外培養(yǎng)建立硬皮病成纖維細(xì)胞系，并用補(bǔ)腎益精法含藥血清干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益精法可抑制硬皮病成纖維細(xì)胞I型膠原α2（Col1α2）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）基因的表達(dá)，提高膠原抑制因子Fli1與Smad7的表達(dá)，同時可減少DNMT1的表達(dá)。補(bǔ)腎益精法源自廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)鄧鐵濤教授對硬皮病辨治經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，能軟化皮膚、改善纖維化表現(xiàn)。補(bǔ)腎益精法軟皮湯方含熟地黃20 g，阿膠、山茱萸各10 g、黃芪、山藥各30 g、紅花5 g、茯苓15 g等。

郭維〔26〕證實(shí)，消痰散結(jié)方（主要由半夏、天南星組成）能夠有效抑制胃癌細(xì)胞系以及裸鼠原位移植瘤的生長，其機(jī)制與逆轉(zhuǎn)抑癌基因p16甲基化水平，增加p16 mRNA表達(dá)水平有關(guān)。

參茸補(bǔ)血丸由人參、鹿茸、杜仲、巴戟天等藥組成，具有補(bǔ)腎填精、益氣生血的功效，在臨床中廣泛應(yīng)用。王蕾〔27〕等發(fā)現(xiàn)大鼠摘除卵巢后，雌激素分泌障礙，生殖器官萎縮，肝、腎組織甲基化酶活力、甲基化水平升高，對應(yīng)組織RNA聚合酶活力明顯降低，處于低表達(dá)；參茸補(bǔ)血丸大、小劑量組大鼠子宮和陰道組織結(jié)構(gòu)與模型組對比有明顯改善，甲基化酶活力、甲基化水平呈規(guī)律性劑量依賴性低下，RNA聚合酶活力明顯提高。說明參茸補(bǔ)血丸能促進(jìn)去勢大鼠生殖器官的發(fā)育，分子機(jī)制之一可能是通過降低甲基化水平，提高RNA聚合酶活力，促進(jìn)相關(guān)功能基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

汪琛穎〔28〕等以糖尿病大鼠為模型，觀察中藥糖維康治療糖尿病腎病的分子機(jī)制。其從糖尿病腎病大鼠的胰組織中提取基因組DNA，用甲基化敏感性限制性核酸內(nèi)切酶HpaII和MspI（為一組同裂酶）進(jìn)行限制性酶切，并進(jìn)行染色質(zhì)DNaseI敏感性分析。研究表明糖維康（太子參、黃芪、玄參、丹參、僵蠶、水蛭等）治療后能向正常方向逆轉(zhuǎn)胰組織DNA中CCGG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)，通過提高基因轉(zhuǎn)錄水平和向正常方向恢復(fù)甲基化狀態(tài)而發(fā)揮其治療作用。

林一萍〔29〕等研究表明益腎健脾方劑能明顯提高生理性腎虛小鼠肝細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，機(jī)制可能是通過改變DNA甲基轉(zhuǎn)移酶空間構(gòu)象，使它更容易向正常的甲基化位點(diǎn)轉(zhuǎn)移甲基，為從分子生物學(xué)的角度探討中醫(yī)益腎健脾延緩衰老的機(jī)理提供了客觀依據(jù)。

通過以上文獻(xiàn)的分析，中藥主要是在腫瘤領(lǐng)域發(fā)揮其DNA甲基化狀態(tài)調(diào)節(jié)作用，通過對甲基化水平的調(diào)控，進(jìn)一步促進(jìn)抑癌基因表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞的存活率，從而影響了疾病的發(fā)展，相信其調(diào)節(jié)作用也能應(yīng)用于葡萄膜惡性黑色素瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等眼科疾病。此外，對于目前具有調(diào)節(jié)甲基化作用的中藥進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)多屬于補(bǔ)腎填精、益氣健脾活血、化痰散結(jié)等方面。根據(jù)中醫(yī)“同病異治”、“異病同治”的經(jīng)典理論，以上治療法則也在眼科中廣泛運(yùn)用，且都收效甚好。表觀遺傳學(xué)方法的出現(xiàn)，為中藥有效性的研究提供了新的方法。

3 展望與挑戰(zhàn)

DNA甲基化在脊椎動物的生命活動中起重要的調(diào)節(jié)作用，參與個體發(fā)育和細(xì)胞分化的過程。與基因序列改變不同，表觀遺傳學(xué)修飾是可逆的，這無疑為治療找到了新的突破口。相信隨著研究的深入，在不久的將來，其在眼科疾病研究中的作用會越來越重要。此外，應(yīng)大力開展中藥有效性的研究，以期能在調(diào)節(jié)DNA甲基化方面發(fā)揮重要作用，更好地服務(wù)于臨床。

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