周圍神經(jīng)損傷動物模型的研究進展

王艷，王茜

周圍神經(jīng)損傷在臨床上較常見，占全部創(chuàng)傷的1.5%～4%[1]。雖然比例較小，但神經(jīng)損傷會引起嚴重的肢體功能障礙，主要以運動障礙、感覺障礙和營養(yǎng)障礙為主，有較高的致殘率[2]。因此是臨床治療和康復治療急需解決的課題，同時也是神經(jīng)生物學實驗的熱點問題。周圍神經(jīng)損傷部位及程度不同，所產(chǎn)生的臨床癥狀也不盡相同；且因周圍神經(jīng)解剖和功能上的特殊性，選擇適當?shù)膶嶒瀯游锱c模型建立方法，對周圍神經(jīng)損傷修復研究有著深遠的影響。本文總結實驗中常用的幾種模型建立方法，并對目前有關周圍神經(jīng)損傷動物模型的建立中存在的問題進行討論。

1 卡壓傷模型

周圍神經(jīng)卡壓傷在周圍神經(jīng)損傷中比較常見。嚴重卡壓傷可導致局部血供受限，繼而引起神經(jīng)損傷段軸索連續(xù)性中斷。此種軸索斷裂傷尚可保持一個完整的神經(jīng)內(nèi)膜管，損傷平面遠端軸突發(fā)生潰變，但因保留了神經(jīng)內(nèi)膜管，有利于神經(jīng)軸索在神經(jīng)內(nèi)膜管有規(guī)則地再生，并可順利到達其支配的靶器官和組織，恢復原有機能，一般情況預后良好[3]。擠壓傷模型常選取此種損傷程度，即SunderlandⅡ度損傷[4]。

1.1 急性神經(jīng)卡壓模型

1.1.1 鉗夾 廖維靖等[5]于20世紀90年代初，選取體質(zhì)量200～250 g雌性Wsitar鼠，采用Hasegawa的方法[6]，用改良的持針器壓至第3格，持續(xù)5 min。持針器表面銼平，中后部銼凹，尖端呈梯形，測得面積約4.4 mm2，持針器壓至第3格時，尖端壓強為0.63 kg/mm2。該實驗介紹了模型建立的操作過程，但是沒有表述神經(jīng)損傷的具體程度。90年代中后期，廖維靖等[7]按文獻[5]的方法取大鼠左后肢近中段坐骨神經(jīng)，距膝2.4 cm處用改良持針器鉗夾神經(jīng)，持續(xù)5 min，造成SeddonⅡ類損傷。鉗夾處可見神經(jīng)菲薄。損傷點用1號絲線輕輕結扎，以期使神經(jīng)損傷較單純鉗夾損傷重。該實驗的優(yōu)點是對模型的神經(jīng)損傷程度定性但沒有定量，此外1號線結扎損傷的程度不能被量化。

王維等在建立鼠坐骨神經(jīng)損傷模型時，于距坐骨結節(jié)6～8 mm處用同一把新的17 cm長止血鉗尖端鉗夾神經(jīng)10 s，壓強為21.95 kPa(以杠桿等效力測定法測定)，神經(jīng)挫壓長度為2 mm[8]。鉗夾后見坐骨神經(jīng)變菲薄，將神經(jīng)放回原位，于神經(jīng)損傷點處用9-0無創(chuàng)尼龍線標記。30 min后檢測大鼠傷側(cè)坐骨神經(jīng)動作電位潛伏期、波幅，當神經(jīng)傳導速度降至10 m/s以下時認為坐骨神經(jīng)軸索及髓鞘斷裂或受到損傷，證實造模成功[9]。該實驗的優(yōu)點之處在于將模型損傷程度進行定量分析，且提出診斷依據(jù)；于神經(jīng)損傷點處用9-0號無創(chuàng)尼龍線不是為加重損傷程度，而是用于標記，這為實驗取材奠定好基礎。但在用尼龍線標記時，應當注意松緊度，過緊會加重損傷程度，過松時尼龍線很容易向遠端滑脫。

1.1.2 硅膠管擠壓 韓清民等[10]參照Mackinnon等[11]所設計的方法，并加以改良，建立坐骨神經(jīng)急性擠壓傷模型。實驗取鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)，游離并顯露坐骨神經(jīng)，將長10 mm、內(nèi)徑0.75 mm的硅膠管縱向切開一邊，套住坐骨神經(jīng)，用6-0號尼龍線縫合，將坐骨神經(jīng)直徑從1.2 mm縮窄到0.75 mm，造成坐骨神經(jīng)(10 mm長)環(huán)形擠壓。術后大鼠置于安靜、溫暖、避強光環(huán)境喂養(yǎng)。24 h后切開原切口，拆除硅膠，即形成坐骨神經(jīng)急性擠壓傷模型。該實驗操作難度較高，需要高精度測量儀器及熟練的操作手法，且24 h后拆除硅膠，又會對實驗動物造成二次損傷。

1.1.3 氣囊擠壓 張立寧等于兔股骨中段后外方尋找并鈍性分離出脛神經(jīng)，在脛神經(jīng)進入小腿三頭肌近1 cm處，用一種新式氣囊壓迫脛神經(jīng)2 min，氣囊壓力為3 kPa，造成長8 mm的神經(jīng)擠壓傷[12]。損傷神經(jīng)HE染色，光鏡下觀察，判斷神經(jīng)損傷程度為SunderlandⅢ度。在損傷部位用1-0號手術線固定于神經(jīng)外膜做標記。該實驗的優(yōu)點在于可通過控制氣壓的強弱，控制所需的神經(jīng)損傷程度，但氣囊的選材尚待商榷，并且氣囊置于脛神經(jīng)進入小腿三頭肌近1 cm處時，應盡量避免牽拉損傷。造成SunderlandⅢ度損傷，由于損傷程度較重，實驗周期可能要相對較長。

1.2 慢性神經(jīng)卡壓傷模型

Koda等認為急性神經(jīng)性疼痛在臨床準確診斷不現(xiàn)實[13]。在研究延遲細胞集落刺激因子引起的機械觸誘發(fā)痛對大鼠坐骨神經(jīng)的治療效果時，Koda等選用成年雌性Sprague-Dawley大鼠制作坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷模型以治療神經(jīng)性疼痛。

楊米雄等[14]參照O'Brien[15]設計的大鼠坐骨神經(jīng)慢性卡壓模型，取右側(cè)臀部斜切口，游離出坐骨神經(jīng)，暴露其長度約2.5 cm，測量坐骨神經(jīng)直徑約1.2 cm，將事先準備消毒好的內(nèi)徑1.2 cm、外徑5.0 cm，改制的硅膠管套在梨狀肌下緣1.0 cm處的坐骨神經(jīng)上，結扎固定造成坐骨神經(jīng)慢性卡壓傷。硅膠管不取出，避免了模型的二次損傷。但實驗并未具體說明卡壓壓力的大小、卡壓具體時間、神經(jīng)卡壓后的損傷情況，以及硅膠管對神經(jīng)的影響情況，并且還應注意硅膠管植入后的抗炎和抗排異反應。

陳曄凌等[16]參照Grace等的方法[17]，建立分級坐骨神經(jīng)縮窄動物模型。實驗動物選用清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠，將坐骨神經(jīng)主干游離約8 mm，用4-0號鉻制羊腸線環(huán)繞坐骨神經(jīng)主干做疏松的單結環(huán)扎，使單結剛好能沿神經(jīng)上下滑動。此種模型建立方法簡單易行，但損傷程度不能定量，每個模型的神經(jīng)損傷程度可能會輕重不一，且在實驗期間疏松的單結環(huán)扎可能松解并脫落而造成實驗失敗。

2 牽拉傷模型

Fullarton等選用山羊建立模型，先用兩把緊鄰著的Dunhill鉗鉗夾神經(jīng)造成擠壓傷，再牽拉至5 mm，然后持續(xù)性牽拉神經(jīng)30 s，使牽拉段神經(jīng)最終長11.5 mm，建立山羊臂叢神經(jīng)牽拉傷的模型[18]。他們主要對牽拉傷神經(jīng)修補時間及方法進行研究。山羊較為溫順，且神經(jīng)較粗大，便于實驗操作與觀察，但由于實驗動物較為昂貴，不能夠廣泛應用；且神經(jīng)損傷屬擠壓與牽拉的復合損傷，并未具體說明損傷程度。

周翠屏等借鑒Fullarton等牽拉傷模型制作方法并進行改良，成功建立坐骨神經(jīng)牽拉傷模型[19]。采用側(cè)臥位以便于充分暴露坐骨神經(jīng)，鈍性分離，游離坐骨神經(jīng)主干，用兩把無齒輸精管分離鉗分別鉗夾坐骨神經(jīng)主干，兩把鉗相距0.5 cm，為盡量減少鉗夾對神經(jīng)的損傷作用，分離鉗僅扣住一齒；均勻用力向兩側(cè)分離兩把分離鉗，將其間的神經(jīng)牽拉到1.0 cm，持續(xù)牽拉30 s，此時可見神經(jīng)被牽拉變細長，松開鉗子，逐層縫合。病理顯示造成周圍神經(jīng)SunderlandⅢ度損傷[20]。該實驗操作易行，不足之處是造成的損傷為卡壓和牽拉的復合損傷，操作中可能對神經(jīng)外膜造成損傷，損傷程度較大。

由于神經(jīng)根軸突無周圍神經(jīng)軸突所具有的抗牽伸作用的豐塔納條紋(fontana)，當暴力牽拉周圍神經(jīng)時，神經(jīng)根受到暴力牽拉作用超過其彈性范圍就會引起結構的變化；神經(jīng)根與外周神經(jīng)相比缺少神經(jīng)外膜和束膜的保護，損傷?？衫奂吧窠?jīng)根，所以更容易受到牽拉的損傷[21]。因此實驗過程中要使神經(jīng)受到牽拉，首先要固定被牽拉神經(jīng)的兩端，但這樣不可避免地造成神經(jīng)兩端的卡壓傷。這種方法均會造成神經(jīng)的復合性損傷，損傷程度較大，并且不容易對神經(jīng)的損傷定性與定量測量。對于建立神經(jīng)牽拉傷的模型的方法，尚有待于繼續(xù)研究。

3 離斷傷模型

神經(jīng)干完全斷裂，斷裂兩端完全分離，或僅以細小的纖維化組織形成瘢痕條索相連，結果是損傷神經(jīng)所支配的運動肌、感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)功能完全喪失，即SunderlandⅤ度損傷。此時受損神經(jīng)支配區(qū)還會出現(xiàn)植物神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為患區(qū)皮膚汗腺、皮脂腺分泌功能障礙[22]。離斷周圍神經(jīng)，通過選擇性切斷運動神經(jīng)或感覺神經(jīng)的方法來模擬一個合理、有效、結果可靠的動物模型，可為失神經(jīng)支配區(qū)病理變化及其影響因素的相關研究提供科學依據(jù)。

趙磊等在大鼠選擇性神經(jīng)損傷實驗模型的建立實驗中選取Sprague-Dawley大鼠，①切斷左側(cè)L4～L6神經(jīng)根前根或后根：麻醉狀態(tài)下，取俯臥位固定，前后根切斷組于背部作后正中L3～S1縱切口，顯露左側(cè)腰椎后結構，咬除關節(jié)突與部分椎板，暴露L4～L6神經(jīng)根。直視下切斷并切除前根或后根1 cm。②坐骨神經(jīng)切斷：于左側(cè)大腿后外側(cè)作弧形切口，顯露坐骨神經(jīng)干，追蹤至梨狀肌下緣5 mm處，切斷并切除1 cm；兩斷端各自翻轉(zhuǎn)180°，分別固定于臀肌及股二頭肌肌膜上，避免神經(jīng)間的自然生長[23]。該實驗通過切斷前根、后根及坐骨神經(jīng)，比較選擇性神經(jīng)損傷所造成的不同結果，這為研究脊神經(jīng)L4～L6神經(jīng)前根、后根及坐骨神經(jīng)受損后，受損神經(jīng)支配區(qū)域的研究提供依據(jù)。

Isaacs等將12只Sprague-Dawley大鼠部分切斷(2/3)左側(cè)脛神經(jīng)。8周后，測試雙側(cè)腓腸肌、比目魚肌和屈趾長肌最大等長收縮力，之后切除肌肉并稱重。結果顯示，患側(cè)與健側(cè)對比只有腓腸肌肌肉在統(tǒng)計學上較弱(P＜0.05)。沒有患側(cè)與健側(cè)之間的肌肉重量差異[24]。此實驗通過神經(jīng)對肌肉的營養(yǎng)支持，證明了脛、腓神經(jīng)所支配的肌肉，為脛、腓神經(jīng)的相關實驗提供理論依據(jù)。

王宇博等在不同長度神經(jīng)片段串聯(lián)再生室對兔坐骨神經(jīng)再生的影響中，分別設置自體神經(jīng)片段串聯(lián)再生室4 mm組、6 mm組、8 mm組和自體神經(jīng)移植組。術后16周觀察顯示，6 mm組和8 mm組優(yōu)于4 mm組，且效果都近似于自體神經(jīng)移植，但6 mm組節(jié)省神經(jīng)，是最為適宜的自體神經(jīng)片段長度[25]。此實驗為神經(jīng)離斷適宜長度提供參考。

神經(jīng)離斷傷造模方法也較多地應用于神經(jīng)損傷的組織工程學研究。王曉亮等在應用人工神經(jīng)修復大鼠坐骨神經(jīng)損傷的實驗研究中，切除坐骨神經(jīng)造成5 mm損傷，借助手術顯微鏡，鏡下縫合人工神經(jīng)于神經(jīng)外膜上，并使神經(jīng)兩斷端分別進入長約9 mm的導管內(nèi)約2 mm，術后5周觀察變化[26]。此種造模方法不僅為周圍神經(jīng)完全離斷后的治療提供新的思路，并且在實驗中采用顯微鏡下操作，使實驗更加精密。但實驗的周期略短，不利于臨床療效的判斷。

4 實驗中動物模型的常見問題

在實驗過程中總會遇到諸多問題，對實驗結果造成影響。其中常見有實驗動物自噬現(xiàn)象，原因可能是由于神經(jīng)損害后神經(jīng)營養(yǎng)障礙、感覺神經(jīng)功能障礙、感覺缺失后肢體反復的機械損傷。坐骨神經(jīng)干受損后，遠端的大部分肢體組織失去神經(jīng)營養(yǎng)及皮膚感覺，因此術后肢體遠端出現(xiàn)關節(jié)僵硬、皮膚潰瘍，部分動物甚至自噬或相互撕咬；經(jīng)久不愈的肢體潰瘍也嚴重影響實驗檢測[19]，嚴重時可導致實驗動物脫落從而影響實驗進程。因此在實驗過程中，實驗動物應盡量分籠飼養(yǎng)，及時更換墊料，對于肢體潰瘍實驗動物應及時清創(chuàng)以保證潰瘍面積不再擴大，并行抗炎治療。

5 小結

在臨床中，神經(jīng)卡壓傷較為常見，同時關于神經(jīng)卡壓傷的實驗研究也是熱點問題，但神經(jīng)損傷模型的神經(jīng)損傷定量分析尚有待于進一步研究，神經(jīng)卡壓傷的實驗研究是難點問題。

在周圍神經(jīng)卡壓傷模型的制作過程中，由于慢性卡壓傷模型的設計存在諸多問題，而急性卡壓傷模型在設計過程中所遇到的問題不斷被完善，因此急性周圍神經(jīng)卡壓傷模型在實驗中多被采用。其中因鉗夾傷操作簡單易行，現(xiàn)已被廣泛認可與應用。王維等以杠桿等效力測定法測定一把新的17 cm長止血鉗尖端壓強為21.95 kPa，使鉗夾損傷程度更加有據(jù)可循。但實驗中神經(jīng)損傷程度的定量仍存在急需解決的問題，如神經(jīng)損傷時所受到的鉗夾力一定，那么鉗夾不同時間所造成的具體損傷程度，還應通過動物實驗進一步闡釋說明。

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